Поделиться Поделиться

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады

К роду Pseudomonas относятся 18 видов (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. cepacia, Ps. mallei, Ps. pseudomallei, Ps. fic-ketti, Ps. stutzeri и др.), которые могут вызвать тяжелые формы инфекций как внутрибольничных, так и ятрогенных типов. Наибольшую важность для медицины и ветеринарии пред­ставляют Ps. aeruginosa, Ps. mallei и Ps. pseudomallei. Эти микроорганизмы неприхотливы по питательным потребно­стям и способны выживать в условиях окружающей среды (Hansen W., 1991). Ps. aeruginosa сохраняет жизнеспособность почти при полном отсутствии источников питания (Toth D. et al., 1983).

Физиология, биохимия и родо-видовые дифференциально-диагностические признаки псевдомонад обобщенно представ­лены в работах Palleroni (1984), Рубан Е. Л. (1986), Мороз А. Ф. и соавт. (1988), Белякова В. Д. и соавт. (1990), Смирнова В. В., Киприановой Е. А. (1990). Достаточно успешными оказались попытки использования с диагностической целью способно­сти псевдомонад ассимилировать отдельные органические ве­щества. В результате спектры углеродного питания также эф­фективно применяются при идентификации, как и «пестрые ряды» для энтеробактерий (Смирнов В. В., Киприанова Е. А. (1990).

Отмечается бесперспективность разработки универсальных сред на основе антибиотиков и красителей для селективного выделения псевдомонад и быстрой их дифференциации от дру­гих грамотрицательных бактерий, так как диапазон видовой чувствительности псевдомонад к этим агентам очень широк (Смирнов В. В., Киприанова Е. А., 1990). По этой же причине выражается сомнение в пригодности подобных сред, уже раз­работанных Grant M., Holt J. (1977), Wakisaka Y., Koizumi К. (1982).

Между тем, большие возможности в плане создания уни­версальных сред открывает использование ЭДТА и солей ба­рия, избирательно подавляющих различные виды Pseu­domonas, независимо от чувствительности их к антибиотикам и красителям.

До сих пор не существует строго регламентированного набо­ра тестов для идентификации Ps. aeruginosa. Как не утративший способности к сапрофитизму, он характеризуется выраженной биохимической активностью, обладает необходимым для дыха­ния набором ферментов, восстанавливает нитраты в нитриты, редуцируя их до газообразного азота, хотя последний тест, по данным Girardi G (1980) может быть отрицательным у 42% штаммов. Характерным биологическим признаком Ps. aerugi-



Ч



ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 1 nosa, значительно упрощающим идентификацию приблизитель­но 70—80% штаммов, является уникальная способность синтези­ровать водорастворимый феназиновый пигмент—пиоцианин, окрашивающий питательную среду в синезеленый цвет. Кроме того, большинство культур образует зеленый, флуоресцирующий в Уф лучах, пигмент флуоресцеин или пиовердин, а также другие пигменты (пиорубин, пиомеланин, аоксифеназин). В некоторых случаях выявляются атипичные беспигментные (8—18%) или слабопигментированные формы (Мороз А. Ф. и соавт., 1988), что объясняется действием сопутствующей микрофлоры, антибио­тиков, недостатком кислорода. Имеется основание считать мела-нинобразующие штаммы более патогенными (Рожавин М. А., 1983).

Уникальным свойством Ps. aeruginosa является способность образования на плотных средах блестящего металлического налета (само название «aeruginosa» означает «покрытая нале­том цвета медной ржавчины»). Однако это свойство встречает­ся нестабильно у всех штаммов данного вида и Калина Г. П. (1984) подробно анализирует литературу о влиянии на выявле­ние этого признака состава среды культивирования. Автор экс­периментально проверил многочисленные комбинации раз­личных компонентов, используемых в средах (триптон «Difco», глицерин, сульфат калия, хлорид магния, нитрат калия, арги­нин, аспарагин, молоко), а также непосредственно среды для интенсификации блеска (МПА с 5% человеческой крови, сре­да с хлоридом N-цетилпиридиния, трехсахарный железный агар, две среды Берка: повышенной питательности за счет уве­личения содержания триптона и с меньшим содержанием пос­леднего, но с введением в состав аргинина). В результате раз­работана среда, содержащая МПА с повышенной концентра­цией пептона, молоко, 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлорид и L-аргинина монохлорид, на которой Ps. aeruginosa, за еди­ничными исключениями, образует металлический блеск высо­кой интенсивности. На практике можно упростить среду заме­нив МПА сухим порошковым агаром и исключив пептон, ар­гинин.

Идентификация беспигментных и слабопигментных штам­мов Ps. aeruginosa может быть упрощена использованием сред, предложенных King E. (1954) для усиления образования пиоциа-нина (среда Кинга А) и флуоресцеина (среда Кинга В), а также сред Калиной Г. П. (1984) и Daly J. et al. (1984).

Ps. aeruginosa хорошо растет и размножается на простых пи­тательных средах в аэробных условиях при 30—37°С и сохраняет эти свойства при 42°С. На поверхности питательного бульона или пептонной воды культуры образуют серовато-серебристую пленку. На МПА, средах Эндо или Плоскирева различают 5 ти­пов колоний: плоские неправильной формы, типа Е. coli, склад­чатые, слизистые и карликовые.


Ps. aeruginosa обладает слабой сахаролитической активно­стью и получает энергию путем окисления самых разнообраз­ных субстратов-сахаров и других углеводов. Окисление одного и того же вещества может происходить по разному в зависимо­сти от условий, при этом гликолиз и цикл Кребса не являются единственными механизмами биохимического превращения углеводов. Глюкоза может окисляться до 2-кетоглюконовой ки­слоты без образования газа в аэробных условиях, тогда как в анаэробных ферментации глюкозы вообще не происходит. При длительной (2—3 сут) инкубации все штаммы окисляют ксило­зу, арабинозу, маннозу (Анохина Р. В., 1973) и выявляют ос-га-лактозидазу (Исхакова X. И., 1980). Возбудитель инертен к лак­тозе, сахарозе, манниту, мальтозе (Lanyi В., 1968) и индолотри-цателен (Исхакова X. И., 1980). Протеолитические свойства, наоборот, хорошо выражены: разжижение желатина, свернутой кровяной сыворотки, гидролиз казеина. Родовым признаком является синтез цитохромоксидазы. Цитохромоксидазная про­ба—достаточно надежный тест для идентификации штаммов Ps. aeruginosa. Этот микроб синтезирует триметиламин, прида­ющий культурам своеобразный запах, напоминающий жасмин, земляничное мыло или карамель.

В качестве таксономического для Ps. aeruginosa признака До-марадский И. В. (1975) рассматривает феномен радужного лизи­са при росте на плотных средах.

Нетребовательность к питательным веществам дает возмож­ность изолировать его на любых достаточно простых жидких и плотных средах. Однако, являясь ведущим возбудителем в пато­логическом материале, Ps. aeruginosa довольно часто находится в ассоциации с другими микроорганизмами, поэтому для его од­ноступенчатого выделения используется целый ряд элективных и дифференциально-диагностических сред. Они должны содер­жать химические соединения, являющиеся либо источником пи­тания только для синегнойной палочки, либо подавляющие рост ассоциативной микрофлоры, не задерживая при этом ее собст­венный рост.

К 1-ому типу можно отнести среды с ацетамидом( Буль С. М., Колкер И. И., 1978; Hedberg М., 1969; Mossel D. et al., 1976), ко­торый используется Ps. aeruginosa в качестве источника азота и углерода, в отличие от других грамотрицателъных микроорганиз­мов и остальных видов рода Pseudomonas. Hedberg M. et al. (1969) рекомендуют для выделения из мочи и отделяемого гнойных ран среду Симмонса с заменой цитрата натрия на ацетамид (2%), по­скольку на ней полностью подавляется рост культур протея. В то же время, Шеина Э. П., Арутчева А. А. (1979) вновь предлагают выделять Ps. aeruginosa из ассоциации с протеем просто на среде Симмонса.





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 2 Korth S. (1963) предложил хинно-кислую среду для иден­тификации Ps. aeruginosa и Ps. fluorescens, исходя из способно­сти их использовать хинную кислоту в качестве источника уг­лерода.

Однако большинство разработок селективных сред ориен­тировано на химические соединения, ингибирующие рост бак­терий- ассоциантов Ps. aeruginosa. В связи с резистентностью к нитрофурановым препаратам для его выделения предложены питательные среды, в состав которых вводится одно из соеди­нений названной группы (Черномордик А. Б., 1971; Carlevaro С. et al., 1963; Thom A. et al., 1971). Наибольшее распростране­ние за ру-бежом получили сухие среды, содержащие в качестве селективного агента цетилтриметиламмоний бромид или цет-римид (Aldridge С. et al., 1964; Brown V, Lowbury E., 1965; Mos-sel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), 2, 4, 4-три-хлоро-2-гидроксифеноловый эфир или иргазан (Robin Т., Jan-da M., 1984).

В нашей стране для одноступенчатого выделения Ps. aeruginosa предложены среды: синтетическая с фурагином (Ароне Р. М., Чур­сина Т. В., 1975), накопительная с бриллиантовым зеленым (Кол-кер И. И. и соавт., 1977; Жарикова М. С. и соавт., 1983), с пропа-нидом (Алешня Е. П., Алешня В. В., 1977), А-1 и А-2 (Исхако-ва X. И., 1979), с этонием и пенициллином (Тыдельская И. Л. и со­авт., 1980), с солями четвертичного аммониевого основания (Мо­роз А. Ф. и соавт., 1976).

Способ, предложенный Алешня Е. П., Алешня В. В. (1977), не получил распространения, видимо, из-за дефицитности про-панида.

Разработанная на основе смеси этония (выпускаемый в Рос­сии детергент, применяемый в медицине главным образом как противостафилококковый препарат) с пенициллином среда об­ладает неплохими селективными свойствами: на ней ингибиру-ется рост не только стафилококков и стрептококков, но и ба­цилл, кишечных палочек, протея; и лишь в единичных случаях вырастают культуры цитробактера и клебсиеллы. К недостаткам указанной среды относятся многокомпонентность и невозмож­ность длительного (более 2 нед.) хранения готового состава в хо­лодильнике из-за инактивации пенициллина (Рожавин М. А., Бугаева Е. А, 1986).

Zacharian P., Listen J. (1973) установили рост Ps. aeruginosa на «голодном» агаре с (3-аланином, глицином или пролином в качестве источника азота. Добавление фурагина вызывало уг­нетение развития других микроорганизмов, но не влияло на рост Ps. aeruginosa.

Liu P. van (1973) рекомендует среду, содержащую белковую основу, глюкозу, NaCl, фосфат калия двузамещенный и воду.

В НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гама­леи (Москва) разработана сухая среда, состоящая из селектив-


ного агента отечественного производства—N-цетилпиридиния хлорида (N-ЦПХ) в концентрации 0,2% (Мороз А. Ф. и соавт., 1976), а также питательной основы из сухого пептического гид-ролизата казеина и минеральных солей магния, калия. Детер­гент N-ЦПХ в концентрации 0,2—0,5% надежно угнетал рост стафилококков, стрептококков и энтеробактерий. Однако, при этом ингибируются и отдельные клинические штаммы синег-нойной палочки. Позже для улучшения селективных свойств данной среды Мороз А. Ф. и соавт. (1980) вводили в нее фено-зан. Начат промышленный выпуск сухой среды с N-ЦПХ и фе-нозаном. По избирательности и количеству положительных высевов она превосходит зарубежные агары с иргазаном и цет-римидом (Бекбергенов Б. М., 1977; Поликарпов Н. А., 1978; Буль С. М. Колкер И. И., 1978; Раку В. Д. и соавт., 1982; Кол-кер И. И. и соавт., 1982), проста в изготовлении и стабильна при хранении. Между тем, отмечаются недостаточная чувстви­тельность ЦПХ - агара (Каплан А. Е. и соавт., 1982) и возмож­ность роста на ней отдельных штаммов протея и цитробактера (Колкер И. И. и соавт., 1982).

Жарикова М. С. и соавт. (1983) провели оценку эффективно­сти ряда жидких (Кесслера, Хоттингера и бульон с 1% глюкозы) с последующим высевом на МПА с бриллиантовым зеленым и плотных (пропанидовая, Эндо, Плоскирева и МПА с бриллиан­товым зеленым) сред при пересевах с бульона Хоттингера для об­наружения Ps. aeruginosa. Из жидких сред наилучшие результаты получены с использованием бульона Хотингера, а наихудшие— со средой Кесслера. Из плотных сред наилучшие результаты по­лучены на пропанидовой среде, сопоставимые между собой—на среде Эндо и МПА с бриллиантовым зеленым, а худшие—на сре­де Плоскирева. При сравнительном изучении ингибирующей способности сопутствующей микрофлоры у сред Симмонса, МПА с бриллиантовым зеленым, ацетамидной, пропанидовой, Эндо, Плоскирева и висмутсульфитном агара (контролем слу­жил МПА), показано отсутствие на всех них роста St. aureus, спо­ровых аэробных бацилл. Е. coli не дали роста на первых 4 средах, на висмут-сульфитном агаре и среде Плоскирева число колоний было в 2—3 раза меньше, чем в контроле, а результаты посевов на среде Эндо совпадали с контролем. Наибольшим ингибирую-щим свойством относительно протея (роящихся штаммов) обла­дали МПА с бриллиантовым зеленым и среда Симмонса. Слабее ингибировала среда с ацетамидом и не ингибировали среды с пропанидом и Плоскирева. Ростовые качества первых 5 сред бы­ли примерно одинаковыми и сопоставимыми с контролем, тогда как на среде Плоскирева и висмут-сульфитном агаре интенсив­ность роста была в 2 раза меньше.

Отмечают возможность замены МПА с бриллиантовым зеле­ным на одну из следующих сред: Симмонса, ацетамидный или пропанидовый агар.





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 3 Считается, что на вторые сутки можно идентифицировать около 75% культур Ps. aeruginosa по морфологии колоний и образованию сине-зеленого пигмента, а остальную часть— на 3-ьи сутки. Однако в связи с чувствительностью к ингибито­рам определенного количества клинических изолятов этого микроорганизма, особенно выделяемых от больных с кистоз-ным фиброзом (до 9%), полагают необходимым, с целью повы­шения эффективности выявления возбудителя, проводить по­севы на селективные и неселективные среды (Fonseca К. et al., 1986).

Отечественным лабораториям МЗ СССР для выделения Ps. aeruginosa рекомендованы в качестве унифицированных ЦПХ-агар и ацетамидный агар (приказ № 535 от 22.05.85, при­ложение 1).

Таким образом, по Мороз А. Ф. и соавт. (1988) наиболее ин­формативными и доступными для лабораторий тестами иденти­фикации Ps. aeruginosa являются рост на среде с N-ЦПХ, поло­жительный цитохромоксидазный тест, способность окислять глюкозу на среде Хью-Лейфсона в аэробных условиях и расти на ацетамидном агаре. Посев на среды Кинга А и В позволяет до­полнительно идентифицировать 5—10% штаммов по образова­нию характерных пигментов.

Evans M. et al. (1986) исследовали чувствительность Ps. aerug­inosa к 7 антибиотикам методом микроразведений в 10 видах жидких сред, главным образом являющихся модификациями бульона Мюллера-Хинтона. Чувствительность к карбеницилли-ну, тикарциллину и пиперациллину слабо варьировала на раз­личных средах. Значительные отличия обнаружены в тестах с мо-ксалактамом и аминогликозидами. Добавление к бульону Мюл­лера-Хинтона сыворотки человеческой крови приводило к появлению 14—50% ложноположительных результатов чувстви­тельности Ps. aeruginosa к моксалактаму. На триптиказо-соевом и питательном бульонах, бульоне для бруцелл обнаружено 10—72% случаев ложной устойчивости к аминогликозидам. Результаты подтвердили необходимость строгого выполнения рекоменда­ций, в соответствии с которыми чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам следует определять на бульоне Мюллера-Хинто­на, стандартизированном по содержанию двухвалентных катио­нов.

Федорина А. П. (1987) использовала для селекции Ps. aerugi­nosa сахарный бульон с добавлением 0,22—0,66 мг/мл сульфата цинка.

Gill V, Stock F. (1987) предлагают среду PFA для одновремен­ного выявления пиоцианинового и флуоресцеинового пигмен­тов Ps. aeruginosa, превосходящую другие аналогичные и состоя­щую из 15 г/л дегидрированного МН-агара («Difco»), 12 г/л же­латинового пептона («Becton Dickinson»), 8 г/л сульфата калия,


5 мл/л глицерина, 1,5 г/л MgCh*6I-LO и 13 г/л агара; рН среды до­водят до 7,2. Учитывая, что во многих практических микробиоло­гических лабораториях пиоцианин расценивается как 1 из основ­ных видовых признаков Ps. aeruginosa, среда PFA поможет, по мнению авторов, упростить и ускорить процедуру его первичной идентификации.

Keeven J., De Cicco В. (1987) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa (высеваемость 100%), в состав кото­рой входят 15 г/л соевого с переваром казеина бульона; 15 г/л агара, 0,1 г/л фенантролина. Рост Ps. fluorescens и Ps. putida на­блюдался в виде мелких колоний и в более поздние сроки, чем Ps. aeruginosa. Рост других псевдомонад, грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей полностью ингибиро-вался. Состав среды более прост и она дешевле, чем ранее разра­ботанные для выделения Ps. aeruginosa среды Pseudosel Agar и Pseudomonas Isolation Agar.

Tomas J., Oliver-Rodes B. (1987) рассматривали вопрос об оп­тимальных концентрациях селективного агента в питательной среде.

Campbell M. et al. (1988) разработали селективную среду для выделения Ps. aeruginosa, состоящую из агара Колумбия, в кото­рый добавлены фенантролин, 9-хлор-9-/ 4- (диэтиламино)- фе-нил/-9, 10- дигидро-10-фенилакридингидрохлорид (С-390) до конечной концентрации 30 мкг/мл каждый. Она превосходила селективные среды с фенантролином, С-390, ацетамидом и цет-римидом.

Гивенталь Н. И. и соавт. (1989) определяли чувствительность Ps. aeruginosa к антибиотикам в жидкой синтетической питатель­ной среде.

Для выявления Ps. aeruginosa Schubert R. (1989) предлагает среду ABGP из пептонного бульона с глюкозой, аргинином и бриллиантовым зеленым, включающую следующие ингредиен­ты (г/л): казеиновый пептон—17; пептон из соевых бобов—3; NaCl—5; сульфат аргинина—10 и глюкоза—0,5. После сте­рилизации и охлаждения в среду добавляют 10 мл крезолово-го красного (0,3%-ый раствор); 7,5 мл бромтимолового си­него (0,2%-ый раствор) и 0,075 мл бриллиантового зеленого (0,5%-ый раствор). Рост Ps. aeruginosa в среде с аргинином в те­чение 48 ч при 37°С сильно зашелачивает ее, в результате чего серовато-зеленая окраска индикатора в среде изменяется до си­не-фиолетовой. Бриллиантовый зеленый в использованной концентрации подавляет рост грамположительных микроорга­низмов, но не токсичен для Ps. aeruginosa. При культивиро­вании проб более 48 ч наблюдаются ложноположительные ре­акции. Для получения чистых культур делается засев из жид­кой среды на плотную после инкубации на ABGP в течение 24-48 ч.





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 4 Синяшин Н. И. и соавт. (1990) изучали физиологические осо­бенности (способность пигментообразования, накопления био­массы) Ps. aeruginosa при использовании питательных субстра­тов, приготовленных по разным технологиям. Накопление био­массы наиболее выражено на модифицированных бульонах Мартена. Перевар по Хоттингеру уступал экспериментальным средам. Однако, окончательную оценку роли питательных сред можно дать, считают авторы, изучив антигенные комплексы су-пернатантов и самой биомассы.

Калина Г. П., Комзолова Н. Б. (1988) приводят достаточно полный обзор применения жидких сред накопления при поис­ках Ps. aeruginosa в объектах окружающей среды и патологиче­ском материале. Авторы рекомендуют модифицированную среду Bonde (замена пенициллина кристаллическим фиолето­вым как более мягким ингибитором), признанную официаль­но и проверенную на большом материале. Для выделения Ps. aeruginosa из пищевых продуктов Szita G., Biro G. (1990) разработали селективную дифференциальную синтетическую среду, основанную на свойстве этого микроорганизма утилиз-ровать аммоний из неорганических источников азота. Она включает ацетамид и ацетат в качестве источников азота и уг­лерода, соответственно. Среда высокочувствительна, стан­дартна, позволяет непосредственно изучать важные дифферен­циальные биохимические свойства, дешева, подлежит хране­нию, может быть приготовлена в сухом виде и пригодна для замены контрольных сред.

Сиволодский Е. П. (1990) рекомендует селективную среду «Pseudomonas APS» для одноэтапного выделения и идентифика­ции Ps. aeruginosa и Ps. putida, обладающую «лучшей чувствитель­ностью и избирательностью, чем перечисленные». Ее примене­ние основано на выявленном свойстве отечественного лекарст­венного препарата оксафенамид (п-оксифенилсалициламид) избирательно подавлять рост бактерий.

Журило А. А. (1991) изучал эффективность новых селектив­ных к Ps. aeruginosa и тормозящих рост сопутствующей микро­флоры агентов: легкодоступного и широко используемого в сель­ском хозяйстве рамрода (пропахлора, ацимида)-2 хлоризопро-пилацетамида и комплекса сульфат гидразина, грамурин, этоний, N-ЦПХ, в котором первый компонент является веду­щим. Эти селективные агенты добавляли в среды РЧЖ (Чаплин­ский В. Я., Журило А. А., 1987) и Ж, соответственно, и сравнива­ли с кровяным и N-ЦПХ агарами. Среды РЧЖ и Ж не содержат дефицитных компонентов, дешевы и малотрудоемки. Техноло­гия приготовления среды РЧЖ представлена Горбуновой М. Л. и соавт. (1984). Она состоит из 7 г/л пептона; 7 г/л KSOi; 1,5 г/л MgSOt; 1,5 г/л MgCL; 12 г/л агар-агара, 40 г/л рамрода и 25 мл/л глицерина. MIC рамрода в среде РЧЖ, обеспечивающая ее селе­ктивность, равнялась 0,00035—0,0004 мкг/мл. Селективный ком-


плекс эффективно действовал при соотношении компонентов (г/л): пептон 18—22; сульфат калия 6—8; сульфат магния 1,7— 2,5; MgCL 1,3—1,7; сульфат гидразина 0,08—0,1; грамурин 0,06— 0,07; этоний 0,003-0,005; N-ЦПХ 0,03-0,04; агар-агар 9,5-12; рН 7,2—7,4. Количество колоний псевдомонад на среде РЧЖ бы­ло в 15—20 раз меньше, чем в контроле (МПА), тогда как на сре­де Ж-лишь в 1,5—2 раза. Колонии на среде Ж значительно круп­нее, чем на других селективных средах.

Сравнительные исследования Якубчак О. Н. (1997) эффек­тивности выделения и идентификации Ps. aeruginosa на средах с цитримидом, этонием, антибиотиками, N-ЦПХ и СА-03 пока­зали относительно высокую их чувствительность (за исключе­нием среды с N-ЦПХ) и селективность (среды с цетримидом и СА-03—на них, помимо Ps. aeruginosa, росли только 2 вида по­сторонней микрофлоры). Скорость роста на всех средах была примерно одинаковой (наибольшая на средах СА-03 и с этони­ем). Тем не менее, с целью повышения селективности, автором разработаны среды М и Mi, особенностью которых является от­сутствие ингибиторов посторонней микрофлоры, отрицательно влияющих и на собственно Ps. aeruginosa. Среды основаны на использовании мочевины (аммиака) в качестве источника азо­та (большинство других бактерий не могут расщеплять мочеви­ну); глюкозы—источника углерода; сульфата—источника сер­ных соединений, необходимых для образования белков; аспа-рагина (в среде М он отсутствует) и ионов К+—для облегчения образования пигмента.

Комзолова Н. В. (1991), оценивая факторы патогенности Ps. aeruginosa, использовала авторскую среду АгЖел 1986)— при определении наличия желатиназы, 5% кровяной агар—ге­молизина, желточный агар—лецитиназы и обезжиренное мо­локо—казеиназы.

Штаммовую зависимость накопления биомассы Ps. aerugi­nosa от среды выращивания установили Нуриддинова Н. Р. и со­авт. (1991). Пигментообразование было наиболее интенсивным на среде из свиных и кроличьих желудков, а также на среде из свиных гузенков по сравнению со средами Мартена и Хоттинге-ра. Применение среды из кроличьих желудков способствовало появлению таксономического признака-металлического блеска с зонами лизиса и повышению антагонистической активности штаммов.

Дорофеев А. Г. (1994) выращивал Ps. aeruginosa на синтетиче­ской среде с глюкозой в качестве единственного источника угле­рода и энергии (Паников Н. С. и соавт.. 1980).

Культивирование Ps. aeruginosa с целью получения экзоток­сина А проводят на плотных и жидких средах (Перт С, 1978; Ба­скакова Н. В. и соавт., 1983; Баснакьян И. А., 1989; Liu P., 1964; Arvidson S., 1973; Alouf J., 1985; Belohlavek S. et al, 1985). Чаще





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 5 всего используется бульон Мартена или триптический соевый бульон.

Аджиева А. А. и соавт. (1987) предложили для его культиви­рования среду, включающую белковую основу, ряд неорганиче­ских солей, а также хелатообразующий агент (дельта-оксидиа-мидоуксусная кислота), связывающий ионы металлов, входя­щих в активный центр металлозависимых протеиназ, блокирующих их действие на экзотоксин А. В связи с изготов­лением среды в двух вариантах, рекомендуется и два способа получения экзотоксина А.

Blumentals I. et al. (1987) разрабатывали среду определенно­го химического состава и двухступенчатый метод культивиро­вания, обеспечивающие увеличение выхода экзотоксина А, вырабатываемого Ps. aeruginosa. При этом шт. РА-103 растили на диализованном триптиказо-соевом бульоне, обогащенном добавлением 1% глицерина и 0,05 М глутамата натрия. Следы железа из бульона удалялись с помощью хелатора Chelex-100. Параллельно использовали синтетическую среду, включавшую набор аминокислот, солей и Сахаров в заданном соотношении. Выращивание вели в 2 этапа. На первом использовали выше­описанный обогащенный триптиказо-соевый бульон и выво­дили культуру на стадию раннего стационара. Затем отмытые клетки пересевали на свежий бульон, полностью освобожден­ный от следов железа и продолжали культивирование еще 5— 6 ч. Накопление биомассы Ps. aeruginosa на бульоне шло при­мерно также, как и на синтетической среде, но после полного удаления Fe2+ выход биомассы с бульона возрастал. Увеличение концентрации глицерина с 2,5 до 35 г/л увеличивало выход эк­зотоксина А в среду выращивания с 0,8 до 2,1 мг/л. Добавление Fe2+ к бульону тормозило синтез мРНК, транслирующей ин­формацию о синтезе экзотоксина А. Напротив, ионы Са2+ уси­ливали его синтез.

Кузнецова Т. Н. и соавт. (1991) оптимизировали процесс глу­бинного культивирования Ps. aeruginosa с целью получения экзо­токсина А использовав определенную дозу экспоненциальной посевной культуры и рациональный режим аэрации.

Известно, что бактериологическая диагностика сапа—опас­ного инфекционного заболевания человека и животных, возбу­дителем которого является Ps. mallei, сложна и не позволяет с уверенностью идентифицировать его среди других псевдомонад. Манзенюк О. Ю. и соавт. (1994) выращивали псевдомонады, в том числе Ps. pseudomallei, Ps. mallei и др., на плотной среде КГК, содержащей 10 мл/г глицерина; 1 г/л КНРО-сЗНгО; 1 г/л КН2РО4; 0,3 г/л MgSO* • 7Н2О; 0,03 г/л FeSO* • 7Н2О; недеионизи-рованный солянокислотный гидролизат казеина с аминным азо­том 30±5 мг%; 15 г/л агара.


С целью обнаружения возбудителя мелиоидоза подозри­тельный материал обычно засевают на МПА или МПБ с 3—5% глицерина. Так как в патологическом материале от больных (гной, мокрота, испражнения и др.) и особенно в объектах внешней среды широко представлена посторонняя микрофло­ра, изолировать возбудителя мелиоидоза прямым посевом не всегда удается. Для подавления других видов микроорганизмов Miller W. et al. (1948) рекомендуют применять различные кра­сители: кристаллический фиолетовый (1:200 000), профлавин, акрифлавин, акридин оранжевый, акридин желтый (1:500 000), фуксин основной или кислый (1:100 000), малахитовый или бриллиантовый зеленые (1:1 000 000). С этой же целью авторы предлагают добавлять в исследуемые пробы 1000 ЕД/мл пени­циллина и после выдержки 3 ч при 37°С сеять на МПА с 3—5% глицерина.

Учитывая малую чувствительность возбудителя мелиоидоза к полимиксину и стрептомицину, Ширяев Д. Т. и соавт. (1976) ре­комендуют добавлять их в питательную среду в соотношении 100 и 50 мкг/мл, соответственно, при исследовании проб из объектов внешней среды. Такие концентрации антибиотиков, подавляя рост большинства видов посторонней микрофлоры, не угнетали рост музейных штаммов возбудителя мелиоидоза.

В качестве обогатительных применяют жидкую среду Леви­на или среду МакКонки. Chambon L. (1955) показал, что при посеве проб воды и почвы, взятых в эндемичных районах, в жидкую среду Левина с пересевом после 48 ч инкубации при 37°С на плотную среду Левина возбудитель удается выделять чаще, чем при прямом посеве этих проб на оптимальную среду. При посеве материала на среду МакКонки (Farkas-Himsley H, 1968) к ней добавляют 20 мкг/мл колимицина. В этих случаях большинство сопутствующих грамотрицательных бактерий не растет. Однако при больших посевных дозах и на этой среде может обильно расти целый ряд микроорганизмов. С целью идентификации бактерий, выросших на среде МакКонки с ко-лимицином, предложено использовать оксидазный тест, а для оксидазоположительных видов—ферментацию сахарозы и маннозы на среде Кинга и выращивание на дезоксихолат-цит-ратном агаре.

Ряпис Л. А., Ширяев Д. Т. (1974) в качестве селективной предложили плотную синтетическую среду, основой которой служит 2% забуференный агар с 0,025% сульфата магния и 0,1% сульфита натрия, к которой добавляется (3-аланин до конечной концентрации 0,03 М. На этой среде при посеве чистых культур многих видов микроорганизмов наблюдался рост лишь возбуди­телей сапа и мелиоидоза, а также синегнойной палочки, но при добавлении 25 мкг/мл неомицина прекращался также рост всех штаммов возбудителя сапа.




3 3-235



 
  ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 6

3*

Разработаны и другие селективные среды для выделения воз­будителя мелиоидоза (Ashdown D., 1979; Galimandi M., Dodin A., 1983) успешно апробированные в экспериментах и эндемиче­ских регионах Юго-Восточной Азии, Австралии, Ирана, Фран­ции.

Показана возможность использования для этих целей стан­дартных диагностических сред: кровяного агара; агара МакКон-ки; цистин-лактозного агара, дефицитного по содержанию элек­тролитов (Walsh A., Wuthiekanun V., 1996).

Поповцева Л. Д. (1982) дает характеристику питательным средам, применяемым для выделения и идентификации возбу­дителя мелиоидоза, и предлагает оптимальную схему.

Фарбер С. М. и соавт. (1977) при получении сферопластов из возбудителей сапа и мелиоидоза и выделении из них мембран­ных структур использовали МПА с 5% глицерина. На этой же среде Денисов И. И. и соавт. (1995) выращивали Ps. pseudomallei СВБДО-141.

По данным Leelarasamee A., Bovornkitti S. (1989) рост оксида-зоположительных Ps. pseudomallei отмечается только на пита­тельном агаре и на среде с минеральными солями.

Плеханова Н. Г. и соавт. (1992) разработали среду (ФГК— бульон), обеспечивающую наиболее высокий уровень продук­ции экзопротеаз при поверхностном культивировании Ps. pseu­domallei. При этом индекс протеолиза составил 4,0; тогда как на среде Лурия—3,6; а на МПБ—2,0. Среда состояла из фермента­тивного гидролизата казеина (1,5%), экстракта кормовых дрож­жей (0,5%), минеральных солей (хлорида натрия, солей железа и магния), рН 6,9 и оказалась наиболее эффективной из 12 изу­ченных, не содержала импортных ингредиентов. Для глубинно­го культивирования использовали среду, содержащую гидроли-заты казеина, гороха, черного альбумина и минеральные соли (Плеханова Н. Г., 1994).

Степин А. А. и соавт. (1992) отмечают снижение продукции микробных клеток и протеолитической активности экзопротеаз возбудителя мелиоидоза в анаэробных условиях. Активная аэра­ция среды увеличивала выход бактериальной массы на 50%, а протеолитической активности—на 30%.

Коллектив под руководством Самыгина В. М. (1994) усовер­шенствовал питательную среду на основе гидролизатов казеина для культивирования возбудителей сапа и мелиоидоза.

Ps. mallei растет на МПГА в виде полупрозрачных серовато-белых колоний с перламутровым отливом, сливающихся в сплошной налет; на МПГБ и синтетической питательной среде (Евглевский А. А., 1973) образует муть, пристеночное кольцо, пленку и осадок, поднимающийся со дна пробирки штопором при встряхивании. На картофельной среде Павловского дает рост блестящих гладких колоний цвета меда, также сливающих­ся и темнеющих со временем. Посев культуры на обезжиренное


молоко вызывает его свертывание без пептонизации на 10—14 сут. Посев производственного штамма на среду Гисса с набором Сахаров не изменяет окраски среды и не вызывает образования газа, тогда как некоторые другие штаммы расщепляют глюкозу и лактозу (цит. по Буковой Н. К., 1996). Ввиду высокой, в сравне­нии с другими микроорганизмами, чувствительностью к анти­микробным препаратам, до настоящего времени не разработано для Ps. mallei достаточно эффективной селективной среды. Ис­пользуемые, тем не менее, для подавления роста посторонней микрофлоры красители и антибиотики при прямом посеве ис­следуемого материала задерживают и без того недостаточно ак­тивный рост возбудителя сапа.

В последние годы все чаще в патологическом материале больных стали встречаться Ps. cepacia—бактерии с весьма широ­ким спектром питания, включающим бензилпенициллин. Осо­бую угрозу они представляют при кистозном фиброзе, вызывая более тяжелые осложнения и больший процент летальных исхо­дов, чем Ps. aeruginosa (Prince A., 1986).

На основе окислительно-ферментативной среды с добавками лактозы, бацитрацина и полимиксина В разработана агаризован-ная селективно-диагностическая среда OFPBL для выделения Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом. Ps. cepacia росли в виде желтых колоний на фоне зеленовато-желтой среды за счет разложения лактозы и даже сильные щелочеобразователи из р. Proteus при росте в ассоциациях с Ps. cepacia не влияли на окра­ску колоний последних. На этой среде процент выделения Ps. cepacia был в 2—3 раза выше, чем на других (Muszynski M. et al., 1986; Welch D.etal, 1987).

Carson L. et al. (1986) сравнивали рост Ps. cepacia, выделенных от больных кистозным фиброзом и из других источников, на се­лективных средах—PCG, OFPBL, ТВ-Т, ацетамидной среде и агаре МакКонки. По сравнению с кровяным агаром (контроль­ная среда) лучшими ростовыми свойствами обладали PCG (93,4% выросших КОЕ) и OFPBL (84,4%), худшими—ацетамид-ный агар (62,7%). На среде МакКонки росли 8,1% шт. Ps. cepacia от больных кистозным фиброзом, 46,8% шт. Ps. cepacia от боль­ных другими патологиями и 84,1% шт. Ps. cepacia из окружающей среды.

Евдокимова Н. В. и соавт. (1994) изучали Ps. fluorescens в про­цессе азотного голодания, выращивая на синтетической среде следующего состава (мг/л): глюкоза—2000—6000; KNO>—3000— 6000; КНРОа-ЮОО; КНРО^-Ю; NaCl-1000; MgS04-7H20-200; СаСЬ-2Н2О-40; KI-0,1; FeCb.6HiO-0,4; MnS04• 4НЮ-0,4; Na2Mo04 • 2№О-0,2; ZnSO* • 7Н>О-0,4; H.BO,-0,5 и ЭДТА-Na-5,0.

Подольская В. И. и соавт. (1994) использовали при изучении разложения цианидного комплекса серебра культурой Ps. fluo­rescens синтетическую питательную среду следующего состава


ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 7 (г/л): КН2РО4-2; K2HPO4-I; Na2CO3.10H2O-0,5; MgSO4-0,3; NaCl—0,1; пептон—0,5; глюкоза—2.

Селективные среды для выделения Ps. putida на сегодняш­ний день фактически не разработаны. Максимова Н. П. и со-авт. (1994) для характеристики флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, продуцируемого бактериями Ps. putida, выра­щивали их в питательном бульоне, среде Кинга В (King Е. et al., 1954), либо минимальной или агаризованной среде М 9 (Мил­лер Дж., 1976), которую перед автоклавированием обрабатыва­ли 8-оксихинолином для выделения ионов железа (Meyer J. et al., 1978).

Седина С. А. (1992) исследовал влияние NaCl и метанола на рост культуры Ps. putida BS-2, утилизирующей диэтиленгликоль в качестве единственного источника углерода. Зависимости удельной скорости роста на среде с диэтиленгликолем от нали­чия в ней NaCl и метанола в диапазоне концентраций 0—4% и 0—20 г/л, соответственно, подчинялись уравнению неконку­рентного торможения. При концентрации NaCl более 4% отме­чено полное разобщение процессов конструктивного и энерге­тического метаболизма.

Кулаев И. С. и соавт. (1987) изучали условия культивирова­ния Ps. lytica, обеспечивающие максимальное накопление в культуральном фильтрате фермента, обладающего бактериоли-тической активностью в отношении ряда грамположительных микробов. Показана возможность синтеза фермента лишь при введении в среду органических источников азота-пептона и триптона. Значительно повышался уровень его синтеза при добавлении в среду убитых клеток St. aureus в дозах от 0,5 до 2,5 мг/мл среды. Мальтоза, сахароза, галактоза, глюкоза и N-ацетилглюкозамин при концентрациях 0,1% в 5—10 раз сни­жали синтез фермента, но стимулировали накопление биомас­сы Ps. lytica. Делается вывод о регуляции биосинтеза фермента по механизму катаболитной репрессии. Отмечено отрицатель­ное влияние на синтез фермента некоторых солей в концентра­циях, используемых обычно для приготовления питательных сред.

Будченко А. А., Викторов Д. В. (1992) анализировали белко­вый спектр Ps. pseudomallei, Ps. cepacia и Ps. aeruginosa при вы­ращивании на различных средах. Анализ пептидограмм куль­тур Ps. pseudomallei показал наибольшее количество фракций в спектре (следовательно более широкий диапазон синтеза пеп­тидов) на минимальной среде Gilardi, меньшее—на F-arape и TSab и минимум—на питательном агаре. Спектры Ps. cepacia и Ps. aeruginosa в гораздо меньшей степени зависели от вида среды.

Жога Л. К. и соавт. (1995) при конструировании транспорт­ной среды для патогенных псевдомонад в качестве консерванта использовали глицерин, ингибиторов—антибиотики и красите-


ли. В состав среды входил также гидролизин, представляющий собой кислотный гидролизат крови КРС. Небольшое количест­во его (0,05%) обеспечивало, однако, питание и сохранение ис­комых псевдомонад. Ингибиторы роста сопутствующей микро­флоры не влияли на возбудителей сапа и мелиоидоза, устойчи­вых к ампициллину (MIC 250—500 мкг/мл), полимиксину (1000 мкг/мл) и генциановому фиолетовому. Состав (г/л): глицерин— 200; гидролизин—0,05; NaCl—5; ампициллин—0,01; полимик-син—0,0025; генциановый фиолетовый—0,0025.

Рожавин М. А., Бугаева Е. И. (1986) представили краткий, но емкий обзор литературы по использованию селективных агентов для выделения Ps. aeruginosa, анализируя их достоинства и недо­статки. Это, помимо описанных выше ацетамида, цетримида N-ЦПХ, N-ЦПХ с фенозаном, этония с пенициллином, пропани-да, бриллиантового зеленого, иргазана, также кристаллический фиолетовый с нейтральным красным (Daly J. et al., 1984), кри­сталлический фиолетовый с телозином и канамицином (Mossel D. et al., 1976), производные 5-нитрофурана-фурациллин, фура-гин, фурадонин (Ароне Р. М., Чурсина Т. В., 1976; Mossel D. et al., 1976; Negretti E, Trabattoni C, 1984), пенициллин с новобиоци-ном с С-390 (Sands D., Rovira A, 1970), С-390 (Marold L. et al., 1981; Araj G., 1984; Robin Т., Janda M., 1984). При использовании индикаторной среды Daly J. et al. (1984) оказалось возможным в первые 24 ч. идентифицировать 97% клинических изолятоввоз-будителя синегнойной инфекции.

Вульфдитер Ш., Петер К. (1992) предлагают для получения 3-гидроксибутиратдегидрогеназы культивировать соответству­ющие микроорганизмы-продуценты из рода Pseudomonas (Ps. putida) на питательной среде, содержащей в качестве ис­точника углерода DL-лейцин, DL-лизин, DL-карнитин, али­фатические углеводороды с длиной цепи С6-С10, а также ис­точники азота и минеральные соли сульфат магния, фосфат натрия двузамещенный, фосфат калия однозамещенный, со­единения железа и хлора. При этом себестоимость конечного продукта снижается.

Марцинкявичене Л. Ю. и соавт. (1991) предлагают с целью повышения активности и чистоты холестеринэстеразы культи­вирование его продуцента Ps. mendocina ВКПМ В-2173 на пита­тельной среде, содержащей (г/л): в качестве источника углерода лактозу 1—5; индуктора-соевую муку 20—40; а также двузаме­щенный фосфат калия 0,5—2,5; семиводный сульфат магния 0,5—0,8; хлорид калия 0,3—0,8; нитрат натрия 1—3; говяжий жир 3—8 и воду.

Завалова Л. Л. и соавт. (1992) сравнивали дестабилазную и пептидазную активности экстрактов Ps. hirudinis, выращенных на различных питательных средах (LB, NB, ВН и синтетиче­ские). Отобраны условия культивирования в больших (до 2 кг биомассы) объемах на В и БВК-средах. Сравнительный анализ





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 8 ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 9 ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 10 бактериальных экстрактов выявил в обоих случаях одинаковый уровень дестабилазной и значительно более высокий уровень суммарной пептидазной активности для БВК-экстрактов.

Бойков Ю. Н. и соавт. (1991) предлагают для повышения вы­хода фермента и его активности при культивировании Ps. stutzeri ВКПМ В-4724-продуцента рестриктазы Psu 1, использовать пи­тательную среду, содержащую (г/л) в качестве источника амин-ного азота панкреатический почечный гидролизат 15—20; а в ка­честве минеральных солей-сульфат аммония 1—2; цитрат натрия 0,5—0,7 и хлорид железа 0,001-0,002.

Бурдь В. Н. и соавт. (1994) перед клонированием гена бром-пероксидазы из Ps. aureofaciens культивировали клетки в среде, содержащей (г/л): бактотриптон—10; дрожжевой экстракт—5; хлорид натрия—5; добавляя при выращивании на чашках Петри 1% агара.

Pierce L., Schroth M. (1994) разработали простую процедуру определения колоний Pseudomonas, которые аккумулируют poly-betahydroxybutyrate (PHB), продукт накопления, характеризую­щий многие нефлуоресцирующие псевдомонады на среде с нильским голубым. Колонии РНВ-положительных бактерий флуоресцировали от ярко оранжевого до желтого цвета под длин­новолновым ультрафиолетовым с когда вырастали на среде, со­держащей РНВ и краситель нильский голубой. Яркие оранжевые флуоресцирующие гранулы были видны внутри клеток, когда рассматривались микроскопически под ультрафиолетовым осве­щением. Колонии флуоресцирующиех псевдомонад не флуорес­цировали на этой среде, флуоресцирующие гранулы не были ви­димы микроскопически. Эта методика позволяет обнаруживать РНВ-положительные псевдомонады без микроскопического ис­следования. Среда с нильским голубым также была полезна как дифференциальная изолирующая для Pseudomonas solanacearam и может быть для других нефлуоресцирующих псевдомонад.

Упомянутая выше среда Кинга А в дальнейшем была моди­фицирована. Meed G., Adams В. (1977) показали, что уменьше­ние содержания цетримида до 10 мкг/мл позволяет расти всем пигментированным и непигментированным психрофильным псевдомонадам. Для увеличения его селективного действия они добавили 50 мкг/мл цефалоридина и 10 мкг/мл фуцидина. В ре­зультате была разработана селективная для псевдомонад среда CFC (Cephaloridine-Fucidin-Cetrimide).

Stanbridge L., Board R. (1994) использовали модифицирован­ную среду CFC для дифференциации мясных псевдомонад и эн-теробактерий. Некоторые виды семейства Enterobacteriaceae раз­вивающиеся на кусках говядины, упакованных в регулируемой атмосфере, могут расти на среде CFC. Добавление 1% аргинина и 0,002% индикаторы рН фенолового красного в эту српду позво­ляло дифференцировать две группы. Псевдомонады продуциро­вали аммиак из аргинина, в то время как энтеробактерии вообще


не использовали этот субстрат. Смещение рН в щелочную сторо­ну внутри и вокруг колоний псевдомонад вызывало розовое ок­рашивание с феноловым красным.

Azad H., Cooksey D. (1995) разработали среду oleander knot agar (OKA) для изоляции Ps. savastanoi из растений олеандра. Среда ОКА содержала (г/л) агара 14,0; L-серина 2.0; дрожжевого экстракта 1,0; NH4*HiPO4-0,5; lGHPO4*3H2O-0,5; NaCl-5,0; MgS04*7H20—0,2; борной кислоты 1,0; ванкомицина0,15; цефа-лексина—0,05; бацитрацина 0,05; ампициллина 0,015; новобио-цина 0,02 и циклогексимида 100. Все 39 штаммов Ps. savastanoi из различных географических областей росли на среде ОКА и коли­чественный выход составлял от 5,7 до 93,6% (в среднем =43.6%). Среда ОКА была селективнее чем другие исследованные среды, включая BCBRVB, M-71, KBBC, MSP, пролиновый агар и PVF-1, и ингибировала от 89 до 96,7% сапрофитных бактериальных штаммов, выделяемых из тканей олеандра. 44% других исследо­ванных бактерий, патогенных для растений, не росли на среде ОКА, а 13% росли скудно. Среда ОКА использовалась для обна­ружения эпифитных популяций Ps. savastanoi из галлов, листьев, стволов и цветов, а также для обнаружения системного движения бактерии в стволах олеандра. Патоген был представлен в про­мывной воде от 26 из 34 предположительно здоровых растений олеандра. 31 из этих растений впоследствии вырабатывали галлы в течение 1 года. Бактерия была также способна к системному движению на 25 см выше и 20 см ниже места инокуляции.

Jeppesen С. (1995) предложил несколько сред, особенно для обнаружения Aeromonas spp., но также для Plesiomonas shigel-loides и Pseudomonas spp. Некоторые из них были предназначены для общих целей, а другие—специально для исследования образ­цов клинических, окружающей среды и пищевых. Все среды яв­лялись селективными из-за наличия антибиотиков, желчных со­лей, красителей и других, аналогичных по действию, агентов, а также дифференциальными, что было основано прежде всего на способности микроорганизмов ферментировать или не фермен­тировать углеводы. Как со всеми селективными средами, выход стрессированных клеток иногда предотвращался и конкурирую­щая флора не всегда полностью ингибировалась так, чтобы необ­ходимы были подтверждающие тесты на предполагаемые поло­жительные колонии. Выбор специфической среды для изоляции Aeromonas spp. будет всегда зависеть от типа рассматриваемого образца или нужды исследователя в качественном обнаружении или количественном выходе. Самым лучшим для количествен­ной оценки Aeromonas spp. из образцов продовольствия и окру­жающей среды оказался крахмал-ампициллиновый агар (starch ampicillin agar—SAA), хотя можно было бы рекомендовать и дру­гие. Имеется потребность в сравнительном анализе, включая агар Rippey Cabelli (mA), ампициллин-желчные соли-инозитол-ксилозный агар (ampicillin bile salts inositol xylose-MIX agar), ам-





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 11 ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 12 пициллин-декстриновый агар (ampicillin dextrin agar—ADA), декстрин-фуксин-сульфитный агар (dextrin fucSsin sulpSite agar— DFS) и крахмал-глутамат-ампициллин-пенициллин-С-глюкоз-ный агар (starch glutamate ampicillin penicillin C-glucose agar— SGAP-10C) в дополнении к SAA. Для рутинного анализа об­разцов окружающей среды и продовольствия на присутствие P. shigelloides, рекомендуется расширенный посев на инозитол-бриллиантовый зеленый-желчные соли (inositol brilliant green bile salts—IBB) и plesiomonas (PL) агары. Для Pseudomonas spp. агар CFC позволяет количественный выход как пигментированных, так и непигментированых штаммов из образцов продовольствия и окружающей среды, в то же самое время ингибируя большинство других организмов.

Szita G. et al. (1995) разработали синтетическую среду (Z-агар) для селективной изоляции Ps. aeruginosa из пищевых про­дуктов. Синтетическая среда—как источник азота и углерода— содержит ацетамид, при разложении которого на аммиак и ук­сусную килоту Ps. aeruginosa продуцирует для себя необходимые питательные вещества для роста. Среда не содержит ингибито­ров. Селективность ее была проверена инокуляцией чистых культур различных микробов, принадлежащих к группам Pseu­domonas, Enterobacteriaceae, Bacillus и Staphylococcus. Полноцен­ность синтетической среды была также проверена общенацио­нальным тестированием с использованием двух образцов моло­ка, содержащих 103/мл (образец молока I) и 105/мл (образец молока II) Ps. aeruginosa. Обнаружено, что селективность синте­тической среды была лучше чем цетримидного агара (Cetrimide-agar) предписанного Венгерским стандартом. Общепринятым национальным тестом не выявлено значительных различий меж­ду результатами, полученными на цетримидном и Z-arapax в слу­чае образца молока, содержащего 105/мл Ps. aeruginosa. Однако в молоке, содержащем 103/мл Ps. aeruginosa, значительные разли­чия обнаруживались в пользу Z-arapa. Результаты были сопоста­вимы и воспризводимы на обоих средах. Новая среда запатенто­вана, производится и продается фирмой «REANAL Fine Chemi­cals» (Венгрия).

Gould W. et. al. (1985) предложили для выделения флуоресци­рующих псевдомонад среды Si и Si, содержащие детергент на-трийлаурилсаркозин и триметоприм.

2.2. Сем. Нейссерии

Известная среда для выделения патогенных нейссерии, со­держащая питательную основу, сыворотку крови, агар-агар и во­ду (Лабинская А. С, 1972), не обеспечивает высоких ростовых свойств (Гаджиева А. Г. и соавт., 1982). Последние авторы для этих целей дополнительно вводят в среду аммониевую соль


5,5 дибром-о-крезолсульфофталеина, а в качестве питательной основы используют казеиново-дрожжевой гидролизат.

West S. et al. (1985) изучали потребление железа патогенными нейссериями (N. gonorrhoeae и N. meningitidis) и по результатам опытов высказали предположение, что экспрессированные у же-лезодефицитных мутантов белки наружной мембраны могут яв­ляться рецепторами трансферрина и лактоферрина.

Усвяцов Б. Я. и соавт. (1987) разработали метод предваритель­ного накопления патогенных нейссерии в среде 199 или Игла для повышения частоты их обнаружения при высеве материала на плотные селективные питательные среды.

Hodge D. et al. (1987) выделили вагинальный штамм нейссе­рии, морфологически и биохимически похожий на менинго­кокк, но серологически на гонококк. Так, при культивировании его на средах без цистеина морфология колоний была типична для N. meningitidis. Это грамотрицательный диплококк, оксида-зо- и каталазоположителен, не расщепляет сахарозу, фруктозу, лактозу и маннит, не обладает p-D-галактозидазной, ДНК-азной и трибутиразной активностью, устойчив к спектиномицину.

Stoakes L. et al. (1987) предложили среду для идентификации в течение 24 ч различных видов p. Neisseria и Branchamella по способности сбраживать сахара. Для приготовления ее основы к 600 мл воды прибавляли 6 г агара Noble, 9 г протеозного пепто­на № 3 («Difco»), 3 г NaCl и 7 мл индикатора Andrade. После пол­ного растворения ингредиентов доводили рН до 8,1 и стерилизо­вали 15 мин при 121°С. К каждым 200 мл основы, охлажденной до 56°С прибавляли по 2 г углевода (декстрозы, мальтозы, саха­розы) и стерилизовали. После этого к каждым 20 мл добавляли по 3 мл суплекса, растворенного в 10 мл дистиллированной воды. Конечное значение рН среды—7,2. Сахаролитическую актив­ность определяли по изменению цвета среды на розовый (в неза­сеянном виде она бесцветна). С ее помощью удалось в течение 24 ч идентифицировать 99,1% нейссерии 9 видов, тогда как на триптиказо-цистиновом агаре—всего 93,7%.

Robinson В., Palma В. (1986) сравнивали методы идентифи­кации Neisseria с помощью коммерческих систем Gonocheck II фирмы «Du Pont» и RIM-N фирмы «Austin Biological» и тради­ционные культуральные методы с использованием агара с цис-тином и Kellogg-arapa. Ошибки при идентификации N. gonor­rhoeae в основном были обусловлены ложноположительными результатами при определении ферментации глюкозы. Эффек­тивность использованных культуральных методов была соот­ветственно равна 67 и 100%, а методов с использованием ком­мерческих систем—99%. Ошибки при идентификации N. meningitidis имели место лишь при использовании Kellogg-ara­pa, эффективность культуральных методов при этом составля­ла, соответственно, 100 и 93,5%. Эффективность методов с ис­пользованием коммерческих систем равнялась 100%. На осно-





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 13 воротка, а также длительность культивирования. Выращивание осуществляли на плотных и жидких средах. В качестве плотных использовали тиамин-цистин-глутаминовый агар—ТЦГА (Гад-жиева А. Г., 1975), содержавший 20% сыворотки крови, 1,5% агар на гидролизате мяса по Хоттингеру; среду «25-й вариант» (Мохов Ю. В., 1983); безбелковую среду с казаминовыми кислотами сле­дующего состава: агар «Difco»—25 г/л, глюкоза—7 г/л, NaCl— 10 г/л, казаминовые кислоты—17,5 г/л, глутаминовая кислота— 170 мг/л, крахмальная паста—0,2 л/л, 20%-ый раствор NaOH— 2,75 мл/л. Жидкими средами являлись модифицированная Коэ-на-Уиллера (Фаньковская Э. К. и соавт., 1969) и синтетическая, состоявшая из набора солей и аминокислот. Показана зависи­мость интенсивности микрокапсулообразования от концентрации в среде глюкозы. При содержании ее 7 г/л и более формирование микрокапсулы угнеталось. При этом, вероятно, образование мик­рокапсулы зависело от глубины расщепления в питательной среде крупных белковых молекул. Формирование микрокапсулы не за­висело от содержания в среде аминного азота в изученных кон­центрациях (от 49 до 160 мг%). Наиболее интенсивно микрокапсу­лы образовывались в синтетической среде и на ТЦГА с 20% сыво­ротки, прогретой в течение 1 ч при 56°С, причем формирование поверхностных структур зависело от типа среды. На средах, содер­жавших сывороточные белки, на поверхности микробов, помимо истинной микрокапсулы, формировалась псевдокапсула. Пло­щадь среза ее увеличивалась с повышением концентрации (0— 20%) сыворотки крови в среде, тогда как на формирование микро­капсулы этот показатель не влиял. Добавление в безбелковую сре­ду Коэна-Уиллера ионов Fe3+ от 0 до 32 мг/л не сказывалось на интенсивности формирования микрокапсулы и росте биомассы.

Вальвачевым Н. И. и соавт. (1984) подготовлены методиче­ские рекомендации, где представлено 9 рецептур сред для выде­ления и идентификации менингококков, рекомендуемых в соот­ветствии с приказом МЗ СССР № 98 от 29.01.81 «О расширении функций Всесоюзного центра менингококковой инфекции».

Морозова Т. В. и соавт. (1998) предлагают для выделения и культивирования менингококов менингоагар, содержащий в ка­честве белковой основы панкреатичекий гидролизат казеина, ав-толизат дрожжевой, ферментативный гидролизат черного амбу-лина (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов), а так­же глюкозу, хлорид натрия и агар-агар.

Jessouroun E. et al. (1995) сравнили экспрессию железорегули-руемого белка наружной мембраны N. meningitidis на триптиче-ском соевом бульоне и синтетических средах: Frantz и неполной Catlin. Хотя экспрессия железорегулируемого белка на первых двух средах не различалась, при получении этих белков для вак­цины предпочтительна среда Frantz, имеющая известный состав.


Род Бордетеллы

Род Bordetella входит в семейство Halobacteriaceae и включа­ет три вида: Bord. pertussis, Bord. parapertussis и Bord. bronchisep-tica.

Wright P. (1991) подчеркивает особенности распространения коклюша в развивающихся странах, связанные с несвоевремен­ной его диагностикой вследствие трудностей культивирования Bord. pertussis.

Для количественных процедур при выявлении и изоляции Bord. pertussis из клинических образцов используется агаровая основа Борде-Жангу (Bordet-Gengou), предложенная еще в 1906 году. Среда превращается в селективную при добавлении мети-циллина. Kendrick, Eldering (1934) заменили 50% человеческой или кроличьей крови, рекомендованной в оригинальной пропи­си, на 15% овечьей, с целью сделать среду более практичной для лаборатории. Кровяной агар Борде-Жангу представляет собой обогащенную казеиновым пептоном среду с добавлением карто­феля и глицерина, являющихся источниками питания Bord. per­tussis. Дефибринированная овечья кровь также обеспечивает пи­тание и, кроме того, позволяет детекцию гемолитических реак­ций с целью идентификации данного микроорганизма.

Гладкие формы Bord. pertussis на среде Борде-Жангу образу­ют колонии блестящие, жемчужно-серого цвета, выпуклые, с диаметром 0,25—1 мм. Они не растут на шоколадном, кровяном, асцитном агарах и среде Лефлера; индол в пептонной воде не об­разуют, углеводы не ферментируют. Колонии промежуточных форм не отличимы от гладких, но на среде Борде-Жангу отмеча­ется гемолиз. Они хорошо растут на кровяном и шоколадном агарах, средах Филдса, Лефлера и МПБ. Шероховатые формы, появляющиеся только при культивировании в лабораторных ус­ловиях, растут на всех средах. На среде Борде-Жангу гемолиз от­сутствует, колонии сухие, зернистые, непрозрачные, коричнево­го цвета (Захарова М. С, Кирьянова Г. П., 1980).

Bord. pertussis не нуждаются для роста в СО:, но некоторые исследователи используют при выращивании 5—10% СОз. При культивировании на угольном агаре к нему добавляют 10% де-фибринированной лошадиной или овечьей крови. В бактерио­логических лабораториях развивающихся стран часто более до­ступна кровь человека. По вышеперечисленным причинам Норре J.. Schlagenhauf M. (1989) изучали влияние типа добавля­емой к угольному агару лошадиной, овечьей и человеческой крови при выращивании Bord. pertussis в атмосфере СО: по сравнению с обычной воздушной атмосферой. В качестве анти­биотика использовали 40 мкг/мл цефалексина. Показано, что в присутствии СО: среднее число колоний ниже, чем при воз­душной аэрации. То же отмечается и на средах с антибиотика­ми. Присутствие человеческой крови снижает рост на угольном



S6


S7


ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 14 агаре, но при отсутствии лошадиной или овечьей ее можно ис­пользовать.

Норре J. (1986, 1988, 1989) в кратких обзорах рассматривает
плотные и жидкие среды для выделения, культивирования и
транспортировки Bord. pertussis, а также селективные агенты-ин­
гибиторы микрофлоры носоглотки. Регламентируются пита­
тельные среды и их составные части производства разных фирм.
В качестве транспортной среды предлагается угольный (или аль-
гинатный) агар с кровью. "

HoppeJ., SchwadererJ. (1989) исследовали эффективность ро­ста Bord. pertussis на 4 агаровых средах: на среде для выделения легионелл с 3 мкг/мл линкомицина; на шоколадно-кровяном агаре (с лошадиной кровью) с 40 мкг/мл цефалексина; на шоко-ладно-кровяном агаре с 3 мкг/мл линкомицина и на шоколадном агаре с 3 мкг/мл линкомицина. Значения скорости роста бакте­рий и числа колоний были наиболее высокими на шоколадно-кровяном агаре с цефалексином. На нем во всех экспериментах был получен 100% рост, а фаренгиальная флора почти полностью подавлялась.

Для приготовления корпускулярной коклюшной вакцины Bord. pertussis обычно культивируют в синтетической жидкой среде SS, разработанной Stainer, Scholte (Стейнер-Шолт). Пос­кольку рост культуры и продукция коклюшного токсина повы­шаются при добавлении в среду SS 2-6-0-диметил-р-циклодекст-рина, Wirsing von К. et al. (1988) использовали среду, обогащен­ную этим соединением для выделения Bord. pertussis из клинического материала, полученного из мазков у детей и взрос­лых. Установлена возможность культивирования на этой среде штаммов Bord. pertussis, которые не росли на угольном агаре.

Chan F. et al. (1987) изучали ингибирующее для Bord. pertussis влияние различных концентраций антибиотиков на кровяном угольном агаре, приготовленном из сухого угольного агара («Ох-oid») с цефалексином и среде Борде-Жангу. На первой росли все изученные штаммы (очевидно из-за наличия в ней угольного компонента), а на среде Борде-Жангу—только 20,2%. Показано сходство аминокислотного состава изученных сред.

Норре J., Vogl R. (1986) показали превосходство культивиро­вания Bord. pertussis на угольном агаре («Oxoid»), содержащем 10% дефибринированной лошадиной крови с добавлением и без 40 мг/л цефалексина, в сравнении со средой Борде-Жангу с добавлением 20% дефибринированной крови овец и 40 мг/л це­фалексина, а также модифицированной среды Jones-Kendrick (по скорости роста, количеству выросших штаммов и качеству колоний. Отмечается также свойство всех штаммов Bord. per­tussis сохранять жизнеспособность при 2—8°С в течение 3 не­дель. Для выделения авторы предлагают угольный агар с кро­вью лошади и цефалексином. Угольный или альгинатный агар с лошадиной кровью и цефалексином оказался более эффектив-


ной транспортной системой, чем агар Jones-Kendrick и среда Amies.

Мерцалова Н. У. и соавт. (1987) отмечают зависимость фено-типической выраженности адгезивных свойств Bord. pertussis от питательных сред.

При выращивании коклюшного микроба в промышленных количествах (для производства токсина, необходимого при кон­струировании бесклеточных вакцин) используются, как прави­ло, полусинтетические или полностью синтетические среды (Ап-dron N. et al., 1988). Семина И. Э. и соавт. (1995) изучили влияние подобных сред на уровень синтеза аденилатциклазы коклюшно­го микроба.

Норре J. et al. (1988) выявили низкую эффективность допол­нительного к угольно-кровяному агару с цефалексином исполь­зования аналогичного бульона с 40 мг/л цефалексина для выде­ления Bord. pertussis.

Бакулина Н. А. и соавт. (1980) показали, что наибольшее на­копление бактериоцинов Bord. pertussis при культивировании на жидких средах наблюдается при использовании среды типа Коэ-на-Уиллера с добавлением 0,1% твина-80 и на бульоне Хоттинге-ра с 1 % глюкозы.

По данным Wardlow A. et al. (1976) концентрация магния в среде выращивания влияет на синтез белковых компонентов ко­клюшного микроба, обладающих протективной и гистаминсен-сибилизирующей активностями.

Morrill W. et al. (1987) выделяли Bord. pertussis из назофарин-геальных мазков, хранящихся в транспортной среде Регана-Леве (Regan-Lowe), используя агары Регана-Леве, Борде-Жангу и с циклодекстрином (CD). Количество жизнеспособных Bord. per­tussis, выделенных на агарах Борде-Жангу и CD, составило, соот­ветственно, 90% и менее 70%, выделенных на агаре Регана-Леве.

Шмелева Е. И. и соавт. (1987) изучали кинетику размножения различных штаммов Bord. pertussis в условиях периодического культивирования в шуттелируемых емкостях и в сосудах с прину­дительной аэрацией 6 синтетических и полусинтетических мало­компонентных питательных сред определенного химического состава.

Смирнов В. Д., Сюндюкова Р. А. (1987) оптимизировали ус­ловия выращивания коклюшных бактерий для получения их эк-зоантигенов—гемагглютинина и токсина, являющихся основны­ми компонентами при получении бесклеточной коклюшной вакцины. Культивирование осуществляли в синтетических и по­лусинтетических питательных средах. В качестве стимулятора токсинообразования использовали 2-6-0-диметил-Р-ииклодек-стрин, оптимальная концентрация (0,05—5 мг/л) которого поз­воляет повысить уровень коклюшного токсина до 10—30 мг/л без существенного изменения динамики его образования.





ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ АЭРОБЫ 2.1. Род Псевдомонады - Инвестирование - 15 Chazono M. et al. (1992) предлагают культивировать Bord. per­tussis в присутствии целлюлозы и ее дериватов с целью получе­ния одновременно больших количеств коклюшного токсина и филаментозного гемагглютинина для приготовления вакцины.

Необходимым условием успешного проведения экспери­ментов по конструированию рекомбинантной противококлюш-ной вакцины является стандартность и высокое качество пита­тельных сред. За рубежом для культивирования Bord. pertussis разработаны специальные среды, в частности уже упоминавши­еся среды Борде-Жангу, Коэна-Уиллера, Стейнера-Шолта. По экономическим причинам российские исследователи использу­ют в работе среду КУА, имеющую, по исследованиям Степан-шиной В. Н. и соавт. (1994), низкие ростовые свойства и кото­рый непригоден для генно-инженерных работ. Авторы на моде­ли КУА создали плотную питательную среду с белковыми основами, разработанными в ГосНИИ прикл. микробиологии (Оболенск): серно-, солянокислотными и панкреатическим гидролизатами казеина и рыбной муки с сохранением других компонентов. Эффективность перечисленных гидролизатов бы­ла сравнима с гидролизатом казеина фирмы «Difco».

Алексеева Л. Н. и соавт. (1998) разработали сухую среду для выделения Bord. pertussis, содержащую солянокислотный гидро-лизат казеина, дрожжевой экстракт, агар-агар, хлорид и карбонат натрия, крахмал, активированный уголь, амилопектин и обеспе­чивающую интенсивный рост данного микроорганизма.

Halper

← Предыдущая страница | Следующая страница →