Поделиться Поделиться

Методы выделения и очистки белков

ПИЩЕВАЯ ХИМИЯ

Вопросы коллоквиума № 1

1. Особенности физиолого-биохимических процессов в биологическом сырье

с неразрушенной клеточной структурой.

2. Интенсивность дыхания как интегральный показатель физиологического

состояния биологического сырья.

3. Функции клеточного компартмента. Особенности биохимических процессов,

протекающих в биологическом сырье с разрушенной клеточной структурой.

4. Строение и функции клеточных мембран. Уровни защиты клетки

от окислительных процессов.

5. Биологические функции аминокислот.

6. Роль и превращения аминокислот в пищевых технологиях.

7. Врождённые нарушения аминокислотного обмена у человека. Фенилкетонурия.

8. Биологические функции пептидов. Пептиды в пищевых продуктах.

9. Биологические функции белков. Роль белков в питании человека. Нормы потребления белков.

10. Пищевая и биологическая ценность белков. Незаменимые аминокислоты.

Аминокислотный скор. Лимитирующие аминокислоты.

11. Проблема обогащения белков лимитирующими аминокислотами

и пути её решения.

12. Белково-калорийная недостаточность и её последствия. Квашиоркор.

13. Нарушение переваривания белков пищи. Пищевые аллергии.

14. Новые формы белковой пищи. Основные задачи технологии производства

пищевых белков.

15. Глиадин и глютенин пшеницы, их особенности. Электрофоретический спектр глиадина, его значение.

16. Основные окислительно-востановительные ферменты биологического сырья (тирозиназа, липоксигеназа, глюкозооксидаза), их роль в пищевых технологиях.

17. Основные гидролитические ферменты биологического сырья (липаза,

гликозидазы, протеазы), их роль в пищевых технологиях.

18. Белки семян бобовых культур, их питательная ценность, особенности белкового комплекса.

19. Белки семян масличных культур, их особенности и значение в питании человека.

20. Белки картофеля, их биологическая ценность.

21. Белки мяса. Показатели качества животных белков.

22. Белковые компоненты молока, их роль в питании человека.

23. Функциональные свойства белков пищевых продуктов.

24. Превращения белков в пищевых технологиях.

25. Методы определения белков в биологическом сырье и продуктах питания.

Методы выделения и очистки белков

Белки, как известно, являются весьма лабильными соединениями и при неблагоприятных воздействиях могут денатурировать, а следовательно, и утратить свою биологическую функцию. Поэтому при их выделении и очистке необходимо придерживаться ряда общих правил, позволяющих избежать денатурации выделяемого белка. Во-первых, все процедуры по выделению белков следует вести при температуре как можно более низкой. Во-вторых, в растворы белка рекомендуется добавлять вещества, связывающие ионы тяжёлых металлов (например, ЭДТА — этилендиаминтетраацетат), а также вещества, поддерживающие на низком уровне окислительно-восстановительный потенциал (цистеин, восстановленный глутатион и др.). В-третьих, следует избегать сильного разбавления белковых растворов, так как это может привести к нарушению четвертичной структуры белка. И, в-четвёртых, реакция среды в растворах, содержащих белок, не должна быть сильнокислой или сильнощелочной.

В процессе выделения и очистки нужный белок отделяют от множества других содержащихся в клетках или ткани белков и небелковых соединений, исходя из таких его свойств, как размер его молекул, растворимость, изоэлектрическая точка, заряд и др. Выделение белка начинается с измельчения (гомогенизации ) испытуемого материала (ткани, клеток). Затем проводится экстракциябелков таким растворителем, который наиболее полно извлекает нужный белок. Для отделения белков от низкомолекулярных веществ можно использовать метод диализа . Путём осажденияорганическими растворителями или солями (чаще всего сульфатом аммония) можно получить белковый осадок и затем его высушить лиофильным способом (в вакууме из замороженного состояния). Такой белковый препарат содержит смесь различных белков. Если необходимо получить белок в более чистом состоянии, применяют один или несколько методов разделениябелков: электрофорез, изоэлектрическую фокусировку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию и др.

Электрофорез . Этот метод разделения белков основан на том, что все они являются амфотерными электролитами и содержат положительно и отрицательно заряженные группировки, количество которых зависит от аминокислотного состава данного белка. В зависимости от величины и знака суммарного заряда, а также от размеров и формы молекулы разные белки передвигаются в электрическом поле с различной скоростью, на чём и основано их разделение.

Изоэлектрическая фокусировка белков . Этим методом белки разделяются на основе различий их изоэлектрических точек. Смесь различных белков наносится на колонку, заполненную амфолинами— смесью полиаминополикарбоновых кислот, способной в электрическом поле создавать непрерывный градиент pH. При пропускании электрического тока белки передвигаются по колонке до тех пор, пока не попадут в зону pH, соответствующую их изоэлектрической точке. Там они останавливаются. Затем получившиеся отдельные фракции белков собирают путём их вымывания из колонки.

Гель-фильтрация . Разделение белков при использовании этого метода проводится на основе различий в размерах их молекул. Пробу наносят на колонку, заполненную мелкими пористыми гранулами высокогидратированного нерастворимого углеводного полимера — сефадекса . Молекулы белков, имеющие сравнительно небольшие размеры, проникают через поры внутрь этих гранул, в результате чего их прохождение через колонку замедляется, тогда как молекулы более крупных белков не могут проникнуть внутрь гранул и проходят через колонку значительно быстрее.

Ионообменная хроматография . Разделение белков в данном случае происходит на основе различий в плотности и знаке их заряда. Если в нейтральной среде (при pH 7) белок имеет положительный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим карбоксильные группы (катионообменником), тогда как отрицательно заряженные белки с ионообменником не связываются, а если белок имеет отрицательный заряд, то он связывается на колонке с ионообменником, содержащим органические основания (анионообменником), и в этом случае с ионообменником не связываются положительно заряженные белки. Связавшиеся с сорбентом белки снимают с колонки путём их вымывания конкурирующим за место связывания с сорбентом раствором соли. Те белки, у которых плотность заряда ниже, вымываются с колонки первыми, за ними следуют белки с более высокой плотностью заряда.

Аффинная хроматография . Данный метод разделения белков основан на принципе их избирательного взаимодействия со специфическими веществами, закреплёнными на носителе. Через колонку, заполненную сорбентом, пропускают смесь белков. При этом все белки, не взаимодействующие с сорбентом, проходят через колонку свободно, и только белок, взаимодействующий с сорбентом, адсорбируется на колонке и задерживается в ней. Этот метод позволяет отказаться от многостадийных, трудоёмких схем выделения и очистки белков и получать высокоочищенные, однородные фракции белков непосредственно из белковых экстрактов.

Применяя методы разделения белков с целью выделения какого-то одного специфического белка из смеси многих белков, необходимо иметь удобный способ контроля, который позволял бы определять эффективность каждой стадии их разделения. Например, при очистке фермента измеряют его каталитическую активность и тем самым отличают от всех других белков. Все операции по выделению и очистке белков контролируют по выходу белка и по его специфической активности.

← Предыдущая страница | Следующая страница →