Поделиться Поделиться

Практичне заняття З

ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА. ТЕХНІКА ПОСІВУ НА ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА

Мета заняття:

— уміти проводити взяття та посів патологічного матеріалу на поживні середовища;

— уміти характеризувати ріст мікроорганізмів на пожив­них середовищах.

Оснащення: сухі та виготовлені поживні середовища: по­живний бульйон, Ендо, ЕМС (Левіна), Гісса, виготовлене сере­довище ЖСА, бактеріологічні петлі, шпатель для посіву, там­пон для зіва, бульйонна культура ешерихій (посівний матеріал), середовище Ендо, кров'яний агар, ЖСА, кольоровий ряд Гісса, МПБ з індикаторними паперовими смужками з ростом культу­ри бактерій, спиртівка, сірники, маркер, гумові рукавички.

План

1. Ознайомлення з поживними середовищами.

2. Техніка посіву патологічного матеріалу на поживні се­редовища бактеріологічною петлею, тампоном, шпате­лем.

3. Принципи культивування аеробних і анаеробних мікро­організмів.

4. Етапи виділення чистої культури мікроорганізмів. Іден­тифікація чистих культур мікроорганізмів.

ч у Хід заняття 1. Ознайомлення з поживними середовищами

Завдання 1. Ознайомтеся з формою випуску, умовами зберігання сухих поживних середовищ.

Сухі поживні середовища випускаються у флаконах із тем­ного скла, пластика або у непрозорих пакетах, зроблених із щільного паперу, алюмінієвої фольги (середовища світлочутли­ві). Посуд, у якому випускають ці середовища, щільно закрива­ють, пробки додатково заливають парафіном, пакети запаюють (середовища гігроскопічні). На флаконах і пакетах обов'язково має бути етикетка, на якій зазначено: назву середовища, при­значення, склад, спосіб приготування, термін і умови зберіган­ня, серію. Готують поживні середовища згідно з інструкцією, зазначеною на етикетці.

2. Техніка посіву патологічного матеріалу на поживні се­редовища бактеріологічною петлею, тампоном, шпателем

Завдання 2. Проведіть посів бактеріологічною петлею на щільне поживне середовище Ендо.

Посів на поживні середовища проводять для бактеріологіч­ного дослідження з метою виділення чистої культури мікроор­ганізмів та її ідентифікації. Для посіву може бути використа­ний як патологічний матеріал, так і культура мікроорганізмів.

Чисту культуру виділяють з однієї колонії, тому посів роб­лять так, щоб виросли ізольовані колонії. Для цього викорис­товують такі прийоми: поверхня середовища має бути підсу­шеною (не повинно бути крапельок конденсаційної вологи), посівний матеріал — розведеним і добре розмішаним, лінія по­сіву — максимально довгою.

Всі маніпуляції, пов'язані з посівом і виділенням культур мікроорганізмів, проводять в асептичних умовах. Під час посі­ву не розмовляють, не роблять зайвих рухів; роботу виконують швидко, посіви тримають не далі ніж на 10 см від полум'я.

Увага! Під час роботи з живою культурою дотримуйте­ся правил техніки безпеки!

Алгоритм "Посів на щільне поживне середовище бактері­ологічною петлею":

— поставте чашку Петрі донизу дном зліва від спиртівки;

— зафламбуйте бактеріологічну петлю, візьміть матеріал для посіву із пробірки;

Увага! Матеріал для посіву в кільці бактеріологічної петлі утворює плівку "дзеркальце".

— підніміть правою рукою кришку чашки Петрі так, щоб в щілину між кришкою та її дном пройшла бактеріологіч­на петля;

— втирайте патологічний матеріал бактеріологічною пет­лею в поверхню поживного середовища біля краю чаш­ки;

— зафламбуйте бактеріологічну петлю;

— охолодіть бактеріологічну петлю, доторкнувшись її кін­цем до внутрішньої сторони стінки чашки Петрі;

— покладіть бактеріологічну петлю на те місце на поверхні середовища, де нанесли патологічний матеріал;

— продовжіть робити посів штрихами по всій поверхні чаш­ки, не відриваючи петлі від середовища;

Увага! Штрихи наносять через всю поверхню середовища від однієї стінки чашки до іншої (протилежної) і розташовують їх якомога ближче один від одного. Завдяки цьому лінія посіву стає якнайдовшою, що дає змогу отримати ізольовані колонії.

—- закрийте чашку Петрі;

— зафламбуйте бактеріологічну петлю, поставте її в банку; —- закрийте спиртівку;

— підпишіть на кришці чашки назву поживного середовища і дату його виготовлення;

— переверніть чашку дном догори, підпишіть номер, дату посіву, назву культури за бінарною номенклатурою.

Увага! Підпис посуду здійснюється відповідно до Держав­них санітарних правил (ДСП 9.9.5.-080-02).

Завдання 3. Проведіть посів бактеріологічною петлею у рідке поживне середовище (МПБ).

Під час посіву у МПБ матеріал розітріть на сухій внутріш­ній поверхні пробірки біля середовища, нахиліть пробірку і змийте матеріал у середовище. Цієї вимоги слід дотримуватися обов'язково, особливо у випадках посіву в'язкої культури.

Практичне заняття З - Инвестирование - 1

Алгоритм "Посів петлею у рідке поживне середовище": — візьміть бактеріологічну петлю в праву руку, зафламбуй-

те її;

— візьміть чашку Петрі з культурою у ліву руку;

— охолодіть петлю, доторкнувшись до внутрішньої стінки чашки;

— заберіть матеріал з однієї колонії;

— поставте чашку Петрі, візьміть пробірку з МПБ;

— візьміть мізинцем правої руки пробку пробірки і притис­ніть її до долоні;

Увага! Пробку постійно тримайте в руці.

— зафламбуйте отвір пробірки;

— тримайте пробірку біля полум'я так, щоб отвір її був не далі як на 10 см від полум'я;

— уведіть петлю в пробірку, розітріть на її стінці матеріал;

— опустіть петлю в поживне середовище, змийте матеріал зі стінки пробірки;

— вийміть петлю з пробірки, не торкаючись її стінок;

— зафламбуйте отвір пробірки, закрийте її пробкою;

— поставте пробірку у штатив;

— зафламбуйте петлю, поставте її в склянку з інструмен­том.

Завдання 4. Ознайомтеся з видами тампонів, що вико­ристовуються для взяття паталогічного матеріалу.

Посів проводять тампоном, яким було відібрано матеріал для дослідження.

Тампони виготовляють шляхом намотування вати на металевий, скляний або дерев'яний стержень. Тампони бу­вають для зіва (ротоглотки) і носа, а також ректальні (для взяття патологічного матеріалу із прямої кишки). Тампони для ротоглотки і носа виготовляють так: на кінчик стерж­ня туго намотують вату, а посередині його роблять ватну пробку. Вата кінчика і пробки не повинна сполучатися між собою, в іншому випадку, якщо такий тампон опустити в рідке поживне середовище, то воно, за законом капілярнос­ті, буде поглинуте тампоном. Ці тампони використовують для взяття патологічного матеріалу не тільки з ротоглотки, носа, а й з вуха, виразки, абсцесу, рани, а також для взяття змивів з рук і поверхні різних об'єктів навколишнього се­редовища.

Ректальні тампони виготовляють так: туго намотують вату на кінці стержня, потім навколо стержня на довжину 10— 12 см, потім роблять ватну пробку.

Виготовлені тампони вміщують у пусті чисті сухі пробір­ки і стерилізують у автоклаві за температури 120 °С протягом 20 хв.

Завдання 5. Проведіть взяття патологічного матеріалу з носа.

Патологічний матеріал з носа беруть ватним тампоном під час обстеження на дифтерію, стафілококове носійство, а також у разі ураження слизової оболонки носа при вірусних респіра­торних інфекціях.

Алгоритм "Взяття патологічного матеріалу ватним тампоном з носа":

— запропонуйте пацієнту сісти обличчям до світла;

— підпишіть на пробірці тампона номер аналізу;

— візьміть тампон у праву руку, звільніть його від пробірки;

— зробіть огляд носових ходів (чи немає пошкоджень сли­зової оболонки);

—- уведіть тампон у носовий хід до кінця ходу;

Увага! Не можна торкатися тампоном зовнішньої поверх­ні носа.

— зберіть слиз зі стінок одного носового ходу, добре притис­куючи тампон;

— зберіть слиз зі стінок другого носового ходу цим самим тампоном, не обертаючи його навколо осі;

— опустіть тампон у пробірку.

Завдання 6. Проведіть посів тампоном на поживне серед­овище ЖС А.

Посів на поживні середовища тампоном роблять за тим са­мим принципом, що і бактеріологічною петлею, тобто необхід­но добре втерти матеріал на невеликій площі, обертаючи там­пон навколо його осі, а потім зробити посів зигзагоподібними штрихами. Лінія посіву має бути якомога довшою з тим, щоб отримати ізольовані колонії.

Посів можна робити коловими рухами, обертаючи тампон і чашку Петрі.

Увага! Під час посіву патологічного матеріалу дотримуй­тесь правил асептики і техніки безпеки!

\/ Алгоритм "Посів тампоном на пластинчасті середовища":

— підпишіть чашку Петрі з середовищем ЖСА (на кришці — назву середовища і дату виготовлення, на дні — номер аналізу, назву культури, дату посіву);

— запаліть спиртівку, поставте ліворуч від неї підписану чашку Петрі із середовищем ЖСА дном догори;

— візьміть тампон у праву руку;

— візьміть чашку із середовищем ЖСА у ліву руку, підне­сіть її до полум'я не далі ніж на 10 см;

— зробіть посів тампоном зигзагоподібними штрихами;

— закрийте чашку;

— закрийте спиртівку;

— опустіть тампон у пробірку.

Завдання 7. Проведіть посів шпателем.

Алгоритм "Проведення посіву шпателем":

— підпишіть чашку Петрі з ЕМС;

— нанесіть на поверхню середовища піпеткою чи бактері­ологічною петлею одну краплю посівного матеріалу або тампоном на сегмент 1x2;

— візьміть у праву руку шпатель (тримайте його як олівець), зніміть з нього папірець, швидко зафламбуйте шпатель;

— покладіть його на нанесену краплю посівного матеріалу на поверхні поживного середовища;

— зробіть посів шпателем (робіть шпателем колові рухи правою рукою, прокручуйте чашку лівою рукою);

Увага! За такого методу посіву отримують рясний ріст мі­кроорганізмів по всій поверхні поживного середовища. Такий посів називається суцільним, або посів газоном.

— закрийте чашку, поставте її догори дном;

— опустіть шпатель у дезінфекційний розчин.

3. Принципи культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів

Умови, необхідні для культивування мікроорганізмів у мікро­біологічній лабораторії, забезпечуються в термостаті.

Завдання 8. Ознайомтеся з будовою термостату, по­ставте посіви у термостат.

Термостат призначений для підтримання у внутрішній час­тині робочої камери стабільної температури, необхідної для проведення бактеріологічних і серологічних досліджень.

Основними частинами термостату є: корпус, металеві двер­цята, прозорі дверцята, робоча камера, блок управління. Корпус виготовлений із тонколистового металу. Всередині корпусу вста­новлена робоча камера, в нижній частині якої закріплені два на­грівальних елементи. Простір між корпусом і камерою заповне­ний теплоізоляційними прокладками, зробленими з гофрованого картону. Корпус закривається металевими дверцятами.

Металеві дверцята зроблені у вигляді двохстінної коробки з тонколистового металу. Простір між двома стінками заповне­ний ізоляційними прокладками. По периметру дверцят укрі­плена гумова магнітна прокладка для ущільнення між дверця­тами і корпусом термостата.

На дверцятах і корпусі є два гвинти з отворами для проволо­ки, на яку вішають пломбу.

Прозорі дверцята дають змогу спостерігати за процесом у робочій камері, не відкриваючи їх і не порушуючи температур­ний режим.

Прозорі дверцята по периметру обклеєні прокладкою з гуми для ущільнення між дверцятами і робочою камерою.

Робоча камера має прямокутну форму, її стінки виготовлені з латуні. У верхній частині камери встановлено датчик темпе­ратури. Для усунення місцевого перегрівання бічні стінки і дно камери обклеєні азбестовим папером. Температурний режим у робочій камері контролюється термометром, який встановлю­ється через отвір, що розміщений у блоці керування. Всередині камери встановлено металеві полички з отворами для полег­шення циркуляції повітря.

Блок керування призначений для автоматичного регулю­вання та підтримання температури в робочій камері. На панелі блоку керування встановлено тумблер, запобіжники, кнопко­вий замикач, сигнальну лампу включення в електромережу і одночасно для підсвічування шкали термометра; сигнальну лампу включення нагрівальних елементів термостата, ручки резисторів для встановлення температурного режиму.

Алгоритм "Підготовка термостата до роботи":

— перевірте, чи заземлений термостат;

— підключіть апарат до електромережі, поверніть тумблер у бік напису "мережа" (рос. мовою — "сеть") — сигнальна лампочка світиться у напівнакалі;

— поверніть ручку резистора, встановіть потрібну темпера­туру;

— відкрийте дверцята;

— поставте чашки Петрі в робочу камеру термостата догори дном;

Увага! Чашки Петрі розміщують на поличках і дні робочої камери гіркою оптимально не більше ніж по 5 штук, нещіль­но, що забезпечує циркуляцію повітря і рівномірне нагріван­ня всіх чашок. Чашки обов'язково ставлять догори дном. Це забезпечує добру аерацію чашок і запобігає потраплянню кон­денсаційної води з кришки чашки на посів, яка перешкоджає утворенню ізольованих колоній.

— закрийте прозорі дверцята;

— закрийте металеві дверцята.

Для успішного культивування мікроорганізмів у лабора­торних чи промислових умовах потрібно правильно підібрати поживні середовища, правильно виконати посів і створити на­лежні умови для культивування: оптимальну температуру, від­сутність світла, вологість, аерацію або відсутність повітря (кис­ню), витримати певний термін культивування.

Оптимальну температуру створюють у термостаті. Біль­шість патогенних мікробів ростуть за температури 37 °С.

Для більшості мікроорганізмів, у тому числі і патогенних, світ­ло не потрібне, тому їх культивують у темряві (термостат має не­прозорі стінки). Вологість — неодмінна умова розвитку мікроорга­нізмів, тому їх краще висівати на свіжовиготовлені середовища.

Аерація необхідна для культивування облігатних аеробів і факультативних анаеробів. У пробірки кисень разом із пові­трям проникає через ватно-марлеві пробки, у чашки Петрі — через щілину між кришкою і дном чашки.

Облігатні анаероби культивують в умовах повної відсутнос­ті кисню в поживних середовищах і навколишньому просторі. Для цього використовують різні методи для видалення кисню із середовища і запобігання насиченню середовища киснем. В умовах лабораторії рідкі поживні середовища регенерують — кип'ятять для видалення кисню, різко охолоджують, засівають і заливають на висоту 1 см стерильним вазеліновим маслом або роблять посів уколом у високий стовпчик агару, інколи агаром з посівом заповнюють трубки і запаюють їх на кінцях. Анаероб­ні умови можна створити в анаеростаті, де культивують мікро­би у вакуумі або атмосфері іншого газу (азоту, пропану тощо), а також в ексикаторі. З повітря, що міститься в ексикаторі, ки­сень поглинають хімічні речовини або запалена свічка.

Деякі мікроорганізми краще культивуються в атмосфері, що містить 5—10 % вуглекислого газу. Це капнофільні мікро­організми (бруцели, менінгококи).

Термін культивування для різних мікробів різний. Біль­шість патогенних мікробів культивують протягом 18—24 год, але деякі ростуть повільніше: бордетели — 3—4 доби, спірохе­ти — 7—12 днів, мікобактерії туберкульозу — до 3 міс.

4. Етапи виділення чистої культури мікроорганізмів. Ідентифікація чистих культур мікроорганізмів

Завдання 9. Вивчіть принципи виділення та ідентифіка­ції чистої культури мікроорганізмів.

В організмі людей, тварин, у навколишньому середовищі патогенні мікроорганізми змішані з умовно-патогенними та сапрофітами, тому виділення чистої культури мікроорганізмів є обов'язковим етапом бактеріологічного (культурального) до­слідження. Це дає змогу ідентифікувати її за певними власти­востями.

На щільних поживних середовищах мікроорганізми утво­рюють колонії. Вважають, що колонія — це видиме скупчен­ня мікроорганізмів, які виросли з однієї клітини, тому чисту культуру виділяють шляхом посіву матеріалу з однієї ізольо­ваної колонії. Виділення чистої культури та її ідентифікацію проводять у декілька етапів:

1-й етап — посів патологічного матеріалу на поживні сере­довища з метою отримання ізольованих колоній (вибір мето­ду культивування, склад поживного середовища залежить від типу живлення і дихання мікроорганізмів);

2-й етап — визначення характеру росту мікроорганізмів на поживних середовищах (культуральних властивостей), відбір характерних колоній;

3-й етап — визначення морфології і тинкторіальних власти­востей мікроорганізмів;

4-й етап — пересівання підозрілих колоній з метою виділен­ня чистої культури мікробів;

5-й етап — перевірка чистоти виділеної культури;

6-й етап — визначення ферментативних властивостей мі­кроорганізмів;

7-й етап — визначення точних маркерів мікроорганізмів: антигенної структури, фагочутливості, коліциногенності, ан-тибіотикограми тощо.

Характер росту мікроорганізмів на поживному середовищі визначає їх культуральні властивості. Ці властивості постійні для кожного виду мікроорганізмів, тому є важливою ознакою під час їх ідентифікації.

У рідких поживних середовищах мікроорганізми можуть утворювати помутніння, осад, плівку, пристінковий ріст.

На щільних поживних середовищах вивчають колонії не­озброєним оком, через лупу або під мікроскопом, результати відмічають у робочому журналі. Характеризують колонії за розміром, формою, контуром краю, прозорістю, рельєфом, ха­рактером поверхні, кольором, структурою, консистенцією.

За розміром колонії бувають: точкові (діаметр менший ніж 1 мм), дрібні (діаметр 1—2 мм), середнього розміру (діаметр 2—4 мм), великі (діаметр 4—6 мм і більше).

Форма колоній буває: правильна — кругла, неправильна — амебоподібна, ризоїдна (нагадує переплетене коріння дерева).

Контур краю визначають неозброєним оком або під мікро­скопом. Він може бути рівний і нерівний. Нерівний край буває: фестончастий — утворює великі заокруглені зубці правильної форми; хвилястий — великі заокруглені зубці виражені нечіт­ко; зазубрений — зубці гострі, різної величини і форми; бах­ромчастий — має ніжні ворсинки; розпливчастий — важко від­різнити межу між колонією і поживним середовищем.

За прозорістю колонії бувають: прозорі, напівпрозорі, не­прозорі, прозорі або напівпрозорі з непрозорим центром.

Рельєф колоній вивчають неозброєним оком або через лупу, розглядаючи колонію згори і збоку. За рельєфом колонії бува­ють: каплеподібні і куполоподібні — мають правильну окру­глу форму у вигляді сегмента кулі, можуть бути слабовипуклі і випуклі; плосковипуклі — випуклі з плоскою верхівкою, у вертикальному розрізі нагадують трапецію; конусоподібні — у вертикальному розрізі нагадують трикутник; плоскі або випу­клі з центром у вигляді сосочка; випуклі з вдавленим центром; плоскі — розстилаються по поверхні середовища.

Поверхня буває матовою або блискучою, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Колонії з гладенькою поверхнею позначають буквою S (від англ. smooth — гладенький), з шор­сткою — буквою R (від англ. rough — шорсткий).

Колір колоній зумовлений пігментом, який продукує куль­тура мікроорганізмів. Переважна більшість патогенних мікро­бів не утворюють пігмент, тому їх колонії безбарвні, у проника­ючому світлі вони прозорі, напівпрозорі або непрозорі. Колонії пігментоутворюючих мікроорганізмів мають різний колір: жов­тий, оранжевий, червоний, чорний, фіолетовий тощо. Так, си-ньогнійна паличка утворює колонії синьо-зеленого кольору, а стафілококи — білого і жовтого.

Структура колоній визначається під мікроскопом. У не­прозорих колоній вона не визначається. За структурою роз­різняють такі види колоній: гіалінові — без видимої певної структури; зернисті — залежно від розміру зерен можуть бути дрібно- і грубозернистими; волокнисті — наявність волокон усередині колонії.

Колонії також можуть бути однорідні і неоднорідні. В одно­рідних будова колонії у всіх її частинах однакова, у неоднорід­них центральна частина або сектор відрізняється від іншої час­тини колонії.

Консистенція — це фізичний стан колонії. її визначають за допомогою бактеріологічної петлі. За консистенцією коло­нії бувають: пастоподібні (нагадують вершкове масло), легко знімаються; в'язкі або слизькі, прилипають і тягнуться за пет­лею; волокнисті, шкірясті, щільні — знімаються з поверхні по­живного середовища у вигляді плівки, відповідно до розміру і форми колонії; крихкі, сухі — розсипаються у разі торкання петлею.

Завдання 10. Визначте й опишіть культуральні власти­вості бактерій на поживному середовищі Ендо.

Алгоритм "Визначення культуральних властивостей мікроорганізмів на пластинчастих середовищах":

— візьміть чашку Петрі у ліву руку, тримайте її проти дже­рела світла на рівні очей дном до себе;

— відмітьте маркером ізольовану колонію;

— опишіть ознаки цієї колонії;

— визначте у проникаючому світлі розмір, форму колонії, контур краю, прозорість;

— покладіть чашку Петрі на ліву руку дном донизу;

— розгляньте колонію у відбитому світлі, визначте рельєф, характер поверхні, колір;

— покладіть чашку на предметний столик мікроскопа до­гори дном, встановіть об'єктив х8, опустіть конденсор, визна­чте структуру колонії;

— визначте консистенцію колонії, торкнувшись до неї бак­теріологічною петлею.

Увага! Консистенцію колонії найчастіше визначають під час виготовлення мазка або пересіванні культури.

Завдання 11. Вивчіть способи виявлення ферментатив­ної активності мікроорганізмів.

Здатність виробляти ферменти (ферментативна активність) у мікроорганізмів кодується генами і є їх постійною індивідуаль­ною ознакою. За ферментативною активністю відрізняються не тільки окремі види мікробів, а й окремі варіанти одного виду. Вони називаються біоварами. Тому вивчення ферментативної активності мікроорганізмів є важливим етапом ідентифікації культури. Ферментативна активність мікробів багата і різнома­нітна, але в лабораторній практиці враховують не всі ферменти, що виробляють мікроби, а тільки ті, за якими можна диференці­ювати генетично близькі між собою види. Найчастіше вивчають ферменти, здатні розщеплювати вуглеводи (сахаролітичні), біл­ки (протеолітичні), сечовину (уреазу), розщеплювати лецитин (лецитиназу), ферменти, що зумовлюють окисно-відновні влас­тивості мікробів (дегідрази, каталазу, оксидазу), а також токси­ни, що руйнують еритроцити (гемолітичні властивості).

Сахаролітичну активність виявляють на поживних середо­вищах, що містять певний вуглевод чи багатоатомний спирт (у мікробіологічній практиці вуглеводи і багатоатомні спирти об'єднують в одну групу). Під впливом сахаролітичних фермен­тів вуглеводи розщеплюються до кислоти і газу (СОа, Н2, СН4). Для виявлення кислот до поживних середовищ додають інди­катор. Накопичення газу виявляють у напіврідкому середови­щі за появою кульок газу в середовищі, розривом середовища, піноутворенням. Цей принцип покладено в основу використан­ня диференціально-діагностичних середовищ Ресселя, Гісса, Ендо, ЕМС та ін.

На середовищі з крохмалем визначають здатність мікро­організмів продукувати фермент амілазу, що супроводжуєть­ся гідролізом крохмалю, — у разі додавання розчину Люголю до засіяного середовища реакція на крохмаль стає негативною (тобто під дією йоду середовище не синіє).

На середовищі з молоком визначають здатність мікроорга­нізмів продукувати фермент лактазу, що розщеплює молочний цукор лактозу до кислоти або до кислоти і газу. При цьому мо­локо зсідається, утворюється казеїн (зсілий білок молока).

Протеолітичну активність мікроорганізмів визначають на середовищах, що містять желатин, молоко, сироватку крові, білок курячого яйця, шматочки вареного м'яса, пептон.

Для виявлення ферменту желатинази мікроби засівають уколом на поживне середовище (м'ясопептонний желатин), ін-кубують за температури 22 °С або 37 °С протягом від 1 до 20 діб. Характер розрідження желатину, спричинений різними мікро­бами, різний. Так, холерний вібріон зумовлює розрідження же­латину у вигляді лійки (суцільне розрідження), збудник сибір­ки — у вигляді перевернутої ялинки (розрідження шарами).

У середовищі з молоком мікроорганізми, які утворюють протеолітичні ферменти, пептонізують казеїн. Тому рідке мо­лочне середовище стає напівпрозорим, має вигляд молочної си­роватки.

Протеолітично активні мікроби гідролізують білки до ін­долу, сірководню, аміаку. Індол утворюється внаслідок роз­щеплення амінокислоти триптофан. Для виявлення індоло-утворення у пробірку із середовищем, в яке засіяна культура досліджуваних мікроорганізмів, вносять індикаторну паперо­ву смужку, просякнуту розчином щавелевої кислоти. Під дією індолу смужка паперу набуває блідо-рожевого кольору. Сірко­водень можна визначити за допомогою індикаторної паперо­вої смужки, просякнутої розчином свинцю ацетату. Під дією сірководню утворюється свинцю сульфід — речовина чорного кольору, внаслідок чого папірець також набуває чорного ко­льору.

Гемолітичні властивості мікробів, тобто здатність руй­нувати еритроцити, визначають на поживних середовищах із кров'ю. Розрізняють два види гемолізу: альфа- і бета-гемоліз. Якщо мікроорганізми спричинюють альфа-гемоліз, то на кров'яному агарі навколо колоній утворюється зелена зона (час­то в такий самий колір забарвлюється і колонія) внаслідок пе­ретворення гемоглобіну на метгемоглобін. У разі бета-гемолізу утворюється прозора зона навколо колонії.

Лецитиназну активність, здатність руйнувати лецитин у мембранах клітин визначають на середовищах із жовтком ку­рячого яйця. Якщо мікроорганізми утворюють фермент леци-тиназу, навколо колоній утворюється райдужний вінчик.

Фермент плазмокоагулазу вивчають на середовищі, що містить цитратну плазму крові. Через 2—3 год культивування в термостаті за температури 37 °С плазма зсідається (не вилива­ється з перевернутої пробірки).

Уреазну активність визначають на середовищах, що міс­тять сечовину. Оскільки уреаза розщеплює сечовину до вугле­кислого газу й аміаку (вуглекислий газ погано розчиняється у воді, а аміак — дуже добре), середовище набуває лужної реак­ції, на що вказує зміна кольору індикатора.

Завдання 12. Визначте ферментативну активність мікро­бів на середовищах Гісса, МПБ, кров'яному агарі та ЖСА.

Алгоритм "Визначення сахаролітичних властивостей мікроорганізмів на середовищах Гісса":

— порівняйте за кольором контрольні (без росту культури)

і дослідні (з ростом культури) пробірки із середовища

Гісса;

зверніть увагу, в якій пробірці змінився колір середови­ща, зробіть висновок про те, які вуглеводи розщеплює культура мікроорганізмів; зверніть увагу на наявність кульок газу.

Примітка. В напіврідких середовищах Гісса визначають та­кож рухливість мікроорганізмів. Нерухливі форми мікро­бів ростуть тільки вздовж уколу, який має циліндричну або конусоподібну форму, середовище залишається про­зорим. Рухливі мікроби спричинюють рівномірне помут­ніння всього середовища.

Визначення протеолітичних властивостей проводять у се­редовищі МПБ з індикаторними папірцями.

Зверніть увагу на колір паперових смужок, зробіть висно­вок про утворення культурою мікробів індолу й сірководню.

Огляньте чашку Петрі із середовищем КА у прямому світлі, відмітьте наявність зони гемолізу, її колір.

Огляньте чашку Петрі із середовищем ЖСА у відбитому світлі, похитайте її, зверніть увагу на наявність зони лецитина-зи (райдужного вінчика) навколо колоній. У разі рясного росту патогенного стафілокока окремі зони лецитинази зливаються у суцільну зону.

Для біохімічної ідентифікації мікроорганізмів у медичній практиці використовують прискорені методи — мікротест-системи (АРІ, Міпіїек, Епіегоіеві; тощо). Вони дають змогу швидко ідентифікувати культуру мікроорганізмів і визначити її антибіотикограму.

Контрольні запитання

1. У якому вигляді випускають сухі поживні середовища?

2. Які дані про поживне середовище наведені на етикетці?

3. Який матеріал використовують для посіву на поживні се­редовища?

4. Яких правил посіву слід дотримуватися, щоб отримати ізольовані колонії?

5. Яких правил слід дотримуватися під час посіву живої культури?

6. Як підписати чашку Петрі після посіву?

7. Яка техніка посіву патологічного матеріалу петлею (на щіль­не і рідке поживне середовище), тампоном, шпателем?

8. Як забезпечити необхідні умови культивування аероб­них і анаеробних мікроорганізмів?

9. Як правильно розмістити чашки Петрі в термостаті?

10. З якою метою визначають ферментативну активність мікроорганізмів?

11. Які групи ферментів враховують під час визначення ферментативної активності?

12. На яких середовищах і як визначають сахаролітичні ферменти мікроорганізмів?

13. На яких середовищах і як визначають протеолітичні ферменти мікроорганізмів?

14. Як визначають гемолітичну властивість мікроорганіз­мів ? Які бувають види гемолізу?

15. Як визначають лецитиназну активність мікроорганізмів?

Тести

1. Номер аналізу підписують:

а) на кришці чашки Петрі;

б) на дні чашки Петрі;

б) на дні чашки Петрі;

в) не має значення.

2. Чашки Петрі з посівом ставлять у термостат:

а) догори кришкою;

б) догори дном;

в) не має значення.

3. Мікроби, що обов'язково ростуть за наявності кисню:

а) мікроаерофіли;

б) облігатні анаероби;

в) облігатні аероби;

г) факультативні аероби.

4. Фактор, що не потрібен для культивування мікробів:

а) оптимальна температура;

б) вологість;

в) повітря;

г) світло.

5. Середовища, найбільш сприятливі для певного виду мікробів:

а) спеціальні;

б) елективні;

в) селективні;

г) основні.

6. Ферменти, що розщеплюють білки:

а) протеолітичні;

б) сахаролітичні;

в) уреаза;

г) гіалуронідаза.

Ситуаційні задачі

1. У поживне середовище з молоком висіяли культуру мі­кроорганізмів. Через деякий час середовище стало напівпрозо­рим. Що стало причиною зміни вигляду середовища?

2. Після посіву харчових продуктів, підозрілих щодо харчо­вого отруєння, у поживному середовищі з молоком через 4 год утворився пухкий згусток казеїну, а пробки повилітали з про­бірок. На які властивості бактерій вказують ці факти?

3. Після посіву мокротиння хворого на пневмонію на по­живне середовище з кров'ю виросли дрібні, вологі, зеленкуваті колонії, навколо яких середовище позеленіло. Дайте пояснен­ня цьому явищу.

4. Через добу після посіву на середовище Гісса з лактозою було виявлено, що бактерії виросли вздовж уколу, середовище залиши­лося прозорим і колір його не змінився. Як оцінити цей результат?

5. Під час зняття пов'язки з гнійної рани було відмічено, що бинти набули синьо-зеленого кольору і запаху суничного мила. Чи можна орієнтовно зробити висновок про те, які бактерії спричинили загнивання рани?

Домашнє завдання

Підготуйтесь до практичного заняття 4.

Рекомендації щодо самопідготовки до практичного

заняття 4

1. Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, запи­шіть у щоденнику тему і план заняття.

2. Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 57—77; практикум, с. 56—66).

Практичне заняття 4 ДЕЗІНФЕКЦІЯ. СТЕРИЛІЗАЦІЯ

Мета заняття:

— знати способи стерилізації та дезінфекції;

— уміти підготувати матеріал до стерилізації;

— уміти проводити дезінфекцію рук, робочого місця, пато­логічного матеріалу.

Оснащення: апаратура для стерилізації: стерилізатор па­ровий (автоклав), сухожарова шафа, інактиватор, апарат для зсідання й інактивації сироватки; тести для перевірки якості роботи стерилізаторів: максимальний і немаксимальний ртутні термометри, хімічні тести, біологічні тести, індикатори стери­лізації; пінцет, вата, дезінфекційні засоби: 0,1 % розчин дезак-тину, стериліум.

План

1. Поняття про асептику та антисептику.

2. Дезінфекція.

3. Стерилізація. Методи стерилізації медичного інструмен­тарію, перев'язувального матеріалу, лабораторного посу­ду, поживних середовищ. Контроль якості роботи стери­лізаторів і якості стерилізації.

4. Проведення дезінфекції піпеток, рук, робочого місця, па­тологічного матеріалу.

Хід заняття 1. Поняття про асептику та антисептику

Хімічні речовини, які згубно діють на мікроорганізми, але не впливають негативно на макроорганізм, та які застосовують для лікування інфекційних хвороб, називають антисептиками.

^Днтисептика — це комплекс заходів, спрямованих на зни­щення мікроорганізмів або пригнічення їх росту на об'єкті

(рана, організм). З цією метою застосовують бактерицидні хі­мічні речовини.

Асептика — система профілактичних заходів (дезінфекція, стерилізація), спрямована на запобігання мікробному забруд­ненню рани, операційного поля, культури мікроорганізмів та ін.

Для проведення дезінфекції і стерилізації використовують різні методи залежно від того, який режим стерилізації вони забезпечують.

2. Дезінфекція

Завдання 1. Ознайомтеся з основними видами дезінфекції.

Дезінфекція — це повне знищення вегетативних і споро­вих форм патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів у навколишньому середовищі (у приміщенні: підлога, стіни, ручки дверей; на поверхні меблів, апаратів, приладів; на по­суді, білизні; у патологічному матеріалі, отриманому від хво­рих, тощо).

Таблиця 2. Методи дезінфекції

Метод дезінфекції Принцип методу
Механічний Миття рукз милом, вологе прибирання приміщення, прання білизни, провітрювання приміщення тощо
Фізичний Кип'ятіння, спалювання, оброблення парою, ультрафіоле­тове опромінювання
Хімічний Оброблення хімічними засобами (антисептиками та дезін­фектантами)

Метою дезінфекції є запобігання передачі збудників від ін­фікованого організму до неінфікованого через об'єкти навко­лишнього середовища. Методи проведення дезінфекції наведе­но у табл. 2.

Дезінфекція буває поточною і заключною. Поточну дезін­фекцію проводять багаторазово протягом дня в лікувально-профілактичних та інших закладах. Заключну проводять одно­разово наприкінці робочого дня, або в осередку інфекції після госпіталізації хворого, переведення хворого в іншу палату, або після смерті пацієнта.

Для дезінфекції використовують багато (понад 250) різних хімічних препаратів. Більшість із них випускають готовими для використання у вигляді концентрованої рідини, розчинів, таблеток, емульсій, суспензій, аерозолів.

Дезінфекційні засоби, зареєстровані в Україні, застосову­ють відповідно до режимів, які регламентовані методичними вказівками і в установленому порядку затверджені головним державним санітарним лікарем України. Останнім часом в Україні зареєстровані ефективні дезінфекційні препарати для проведення поточної і заключної дезінфекції: МедіДес, Тетра­лін, КвікДес, Сентамін та ін. їх можна використовувати для знезараження поверхні приміщень, твердих меблів, медичних приладів і апаратури, предметів догляду за хворими, лабора­торного посуду, забрудненого виділеннями хворих, білизни, прибирального інвентарю, а також кухонного посуду.

Для гігієнічного оброблення шкіри рук медичного персоналу ре­комендовано препарати БактеріоСол, Октенісепт, Стериліум та ін.

Дезінфекційні засоби можуть негативно впливати на макро­організм, тому під час виготовлення дезінфекційних розчинів слід дотримуватися правил техніки безпеки (працювати в гумо­вих рукавичках, герметичних окулярах, надягати чотириша­рову марлеву пов'язку).

3. Стерилізація. Методи стерилізації медичного інструмен­тарію, перев'язувального матеріалу, лабораторного посуду, поживних середовищ. Контроль якості роботи стерилізато­рів і якості стерилізації

Завдання 2. Ознайомтеся з методами стерилізації ме­дичного інструментарію, перев'язувального матеріалу, ла­бораторного посуду, поживних середовищ.

Стерилізація — це повне знезараження об'єктів навколиш­нього середовища (знищення вегетативних і спорових форм мі­кробів).

Стерилізація дає змогу запобігти занесенню мікробів в орга­нізм людини під час медичних втручань; обсіменінню сторонньою мікрофлорою патологічного матеріалу, культур мікроорганізмів, які досліджують, а також поживних середовищ, лікарських і діа­гностичних препаратів. Способи стерилізації подані на схемі 1.

Фізичний спосіб. Застосовують термічну, механічну та про­меневу стерилізацію. Термічні способи стерилізації наведено у табл. 3.


Практичне заняття З - Инвестирование - 2

Термічний Механічний Променевий

Біологічний


Практичне заняття З - Инвестирование - 3

Схема 1. Способи стерилізації


Спосіб, апаратура Режим стерилізації Застосування способу, недоліки, особливості
Кип'ятіння у воді Кип'ятіння у 2 % розчині натрію гідрокарбонату 100 °С, ЗОхв 100 °С, 15 хв Вироби медичного призначення, в тому числі інструменти. У мікробіологічній практиці — предметні стекла
Пастеризація 65 °С, ЗО хв; 72—75 °С, 15—30 хв одноразово з подальшим охолодженням Харчові продукти: молоко, вино, пиво, плодові соки
Гласперленова стерилізація 190—250 °С, занурення в середовище на­грітих скляних кульок Цільнометалічні стоматологічні інструменти

Стерилізація кип'ятінням є неповною, оскільки спори бак­терій та деякі віруси не знищуються. Тому цей вид стерилізації часто відносять до дезінфекції.

Під час пастеризації гинуть переважно молочнокислі бак­терії. Дріжджі, спори та деякі вегетативні форми бактерій не гинуть.

Завдання 3. Ознайомтеся з апаратурою для термічної стерилізації та тестами контролю якості роботи стери­лізаторів.

Стерилізацію паром під тиском проводять у паровому сте­рилізаторі (автоклаві), основними частинами якого є стерилі­заційна камера, парогенератор, система трубопроводів, крани керування, манометр електроконтактний та мановакуумметр (манометр). Матеріал вміщують у стерилізаційну камеру, тем­пература в якій залежить від тиску пари: при 0 атм — 100 °С, 0,5 атм— 112 °С, Іатм — 120 °С, 1,5 атм — 126 °С, 2 атм — 132 °С. Температура і термін стерилізації визначаються якістю матеріа­лу і властивостями мікроорганізмів, якими він забруднений.

Сухожарова шафа використовується для висушування лабо­раторного посуду за температури 100—105 °С, а також для сте­рилізації медичного інструментарію за 160 °С протягом 150 хв або за 180°С — 60 хв.

Інактиватор використовують для інактивації сироватки крові (комплемент сироватки крові переходить у неактивний стан за температури 56 °С протягом ЗО хв), а також для багато­разової стерилізації — тиндалізації.

Апарат для зсідання, інактивації сироватки крові, зсідання яєчних і сироваткових поживних середовищ використовуюють одночасно і для їх стерилізації за температури 90 °С по 60 хв 2 доби поспіль.

Контроль температури в стерилізаційній камері проводять за допомогою трьох видів тестів: фізичного, хімічного та біоло­гічного.

-Фізичний метод полягає у використанні максимального термометра в паровому стерилізаторі (автоклаві) і звичайного ртутного термометра в сухожаровій шафі та інактиваторах.

-Хімічний метод — використання кристалічних хімічних речовин з певною температурою плавлення: бензонафтол — 110 °С, антипірин — 113 °С, резорцин, сірка — 119 °С, бензойна кислота, бета-нафтол — 120 °С, сечовина, фенацетин, манноза

— 132 °С, саліцилова кислота, стрептоцид — 160 °С, тіосечови-на, альбуцид — 180 °С.

Одну з цих речовин змішують із невеликою кількістю барв­ника (фуксину або метиленового синього) і вміщують у трубоч­ку, яку потім запаюють. Ці трубочки вміщують у стерилізаційні коробки разом із матеріалом, що стерилізується. Якщо темпе­ратура в стерилізаційній камері сягає певного рівня, то хімічна речовина в трубочці розплавляється, змішується з барвником і забарвлюється в його колір.

Нині випускають паперові індикатори стерилізації, які змінюють забарвлення за певної температури: 1С — 120, 1С — 132 °С та ін.

^-Біологічний метод — використання біотестів (від грец. bios

— життя і англ. test — проба, дослідження). Біотести виготов­ляють відповідно до методичних рекомендацій "Лабораторный контроль качества дезинфекционных мероприятий в ЛПУ" (Харків, 1988). Для їх виготовлення використовують тест-культуру (мікроорганізми з групи антракоїдів, які витримують кип'ятіння протягом 25—ЗО хв і вплив текучої пари темпера­турою 100 °С протягом 4—6 хв) або зразки ґрунту, що містять спори термостабільних сапрофітів (витримують температуру 120 °С протягом 2—3 хв). У стерилізатор вміщують щонаймен­ше 5 біотестів (у різних його місцях) та 1 (контрольний тест) за­лишають за кімнатної температури. Після стерилізації змиви з біотестів засівають на поживні середовища. У змивах з тих біотестів, що перебували в стерилізаторах, росту культури не повинно бути, у змивах з контрольного тесту — рясний ріст культури. Якщо з'являється ріст культури у змивах, взятих із тестів, що перебували в стерилізаторі, перевіряють технічний стан апарата. Здебільшого біотести використовують у парових стерилізаторах і дезінфекційних камерах.

З метою профілактики внутрішньолікарняних інфекцій контролюють не тільки режим роботи стерилізаторів, а й якість стерилізації.

Для цього стерильний матеріал відбирають в асептичних умовах. Від великих об'єктів (бинти, простирадла, шовний ма­теріал) відрізають стерильними ножицями шматочки; серед дрібних предметів — відбирають по декілька штук стерильним пінцетом з різних місць біксу; з хірургічного інструментарію, іншого обладнання роблять змиви стерильними серветками, змоченими стерильним ізотонічним розчином натрію хлори­ду. Дослідження проводять у стерильному боксі в асептичних умовах. Змиви з усіх відібраних об'єктів засівають на поживні середовища, дрібні об'єкти занурюють у поживне середовище. З метою самоконтролю посів проводять на одне поживне серед­овище у дві паралельні пробірки. Для виявлення анаеробів ви­користовують тіогліколеве середовище, яке інкубують за 32 °С протягом 8 діб. Для виявлення грибів використовують серед­овище Сабуро, яке інкубують за 22 °С протягом 8 діб. Матеріал вважають стерильним, якщо в усіх посівах відсутні ознаки рос­ту мікроорганізмів.

^Механічна стерилізація (холодна стерилізація) проводить­ся методом фільтрації через бактеріальні фільтри (мембранні, каолінові та ін.). Використовують для стерилізації розчинів, що не витримують нагрівання (поживне середовище, що міс­тить розчинений білок, сироватку крові, антибіотик). Ця сте­рилізація неповна, оскільки у фільтраті зберігаються віруси, тому її використовують також для відокремлення вірусів від бактерій, у тому числі і фагів.

ч Променева стерилізація. Використовують ультрафіолетове випромінювання (бактерицидні лампи). Цим методом знезара­жують повітря, поверхні приміщень (операційної, пологових залів, боксів), предметів, обладнання, воду, харчові продукти. Радіаційне випромінювання використовують для знезаражен­ня шприців, систем для переливання крові, посуду та інших предметів одноразового використання.

Хімічний спосіб. Хімічну допоміжну стерилізацію застосо­вують тоді, коли неможливо використати термічну (табл. 4).

Таблиця 4. Хімічні способи стерилізації

Хімічні речовини Режим стерилізації Призначення стерилізації
1 % розчин дезоксону-1 18 °С, 45 хв Вироби з полімерів, гуми, скла, коро­зійностійких металів
Хлороформ, толуол, ефір, фенол, формалін, етиловий спирт та ін. Консервування Ендоскопічний інструментарій, кетгут, апарат для штучного кровообігу, по­живні середовища, вакцини, лікувальні та діагностичні сироватки
Гази або суміші газів: озон, оксид етилену, суміш ОБ (оксиду етилену і броміду метилу) 18—80 °С Вироби медичного призначення із по­лімерів, скла, металу

Біологічний спосіб. Біостерилізація ґрунтується на застосу­ванні антибіотиків. її використовують під час культивування вірусів і деяких видів бактерій (бордетел, менінгококів).

4. Проведення дезінфекції піпеток, робочого місця, патологічного матеріалу, рук

Завдання 4. Ознайомтеся з технікою проведення дезін­фекції піпеток, інфікованого матеріалу, робочого місця.

Градуйовані, пастерівські піпетки, шпателі, металеві ін­струменти відразу після використання опускають у посудину з дезінфекційним розчином, яка стоїть на кожному робочому місці.

/Відпрацьований патологічний матеріал (кал, сеча, мокро­тиння, кров, спинномозкова рідина) обробляють сухими дезін­фекційними засобами або їх розчинами. Патологічний матеріал (гній, сеча, кров, мокротиння тощо), посуд, меблі та примі­щення знезаражують бактерицидними дезінфекційними засо­бами. Ці засоби застосовують у комбінації з детергентами та дією високої температури. Вибір дезінфекційного засобу, його концентрація, експозиція (термін дії) залежать від біологічних властивостей мікроорганізмів і властивостей патологічного ма­теріалу, в якому містяться ці мікроби. Так, для знезараження мокротиння хворого на туберкульоз застосовують 2,5 % розчин дезактину (експозиція — 360 хв), а випорожнень хворого на ди­зентерію — 0,5 % розчин дезактину (експозиція — 60 хв). Або засипають сухим хлорним вапном із розрахунку 200 г дезін­фекційного засобу на 1 кг виділень, перемішують і витримують 1 год. Посуд опускають в 1 % розчин хлораміну на ЗО хв або 1 % розчин МедіДес чи Тетраліну на 60 хв.

Робоче місце після закінчення роботи протирають ганчір­кою, змоченою дезінфекційним розчином (0,2 % розчином Сеп-таміну, 0,75 % розчином МедіДес чи Тетраліну).

Завдання 5. Проведіть дезінфекцію рук.

Алгоритм "Дезінфекція рук":

— зробіть із вати дві кульки діаметром 1—2 см;

— візьміть пінцетом одну кульку, змочіть її у розчині дезін­фектанту;

— протріть нею руки в такій послідовності: ліва рука — тильна сторона, долонна сторона, між пальцями, нігтьо­ва пластинка, під нігтями; права рука — у такій самій по­слідовності;

— кульку опустіть у посудину з дезінфекційним розчином;

— візьміть пінцетом другу кульку і все повторіть;

— вимийте руки водою з милом;

— висушіть руки, змастіть їх кремом для рук.

Контрольні запитання

1. Що таке асептика й антисептика?

2. Що таке дезінфекція? Які є її види?

3. Які дезінфекційні засоби можуть бути використані в Україні?

4. Від чого залежить вибір дезінфекційного засобу і термін проведення дезінфекції?

5. Як дезінфекційні засоби впливають на макроорганізм? Як з ними слід поводитися?

6. Що таке стерилізація? Які існують види стерилізації?

7. Які апарати використовують для стерилізації?

8. Які умови стерилізації в паровому стерилізаторі, сухо-жаровій шафі, інактиваторі, в апараті для зсідання й інактивації сироватки?

9. Як контролюють режим роботи стерилізаторів?

10. Як проводять перевірку якості стерилізації?

11. В якому разі і як проводять механічну стерилізацію?

12. Як проводять дезінфекцію піпеток, патологічного мате­ріалу, робочого місця, рук?

Тести

1. Дія дезінфекційних засобів на мікроорганізми залежить
від:

а) природи дезінфекційних засобів;

б) концентрації та температури їх розчинів;

в) тривалості дії;

г) усі відповіді правильні.

2. Для стерилізації бактеріологічних петель використовують:

а) фламбування;

б) сухожаровий метод;

в) тиндалізацію;

г) гласперленову стерилізацію.

3. Медичні вироби з гуми, полімерів, скла стерилізують:

а) 1 % розчином дезоксону-1;

б) хлороформом;

в) ефіром;

г) толуолом.

4. Неповним є метод стерилізації:

а) сухим жаром;

б) автоклавуванням;

в) ультрафіолетовим випромінюванням;

г) кип'ятінням.

5. Медичні вироби одноразового використання (шприці) сте-
рилізують:

а) ультрафіолетовими випромінюванням;

б) радіаційним випромінюванням;

в) водяною парою;

г) сухим жаром.

Ситуаційні задачі

1. У сухожарову шафу помістили металічні інструменти, вату, піпетки, флакони з ізотонічним розчином натрію хлори­ду, гумові рукавички і простерилізували за температури 180 °С протягом 60 хв. Дайте оцінку цим діям.

2. Під час бактеріологічного дослідження вовни був виді­лений збудник сибірки. Після ідентифікації збудника лабора­торний посуд, який був при цьому задіяний, і культуру збудни­ка простерилізували в паровому стерилізаторі за температури 120 °С протягом ЗО хв. Дайте оцінку цим діям.

3. У корови, хворої на туберкульоз, мікобактерії виділяють­ся з молоком. Чи можна пити молоко хворої тварини після пас­теризації?

4. Металеві хірургічні інструменти прокип'ятили у дисти­льованій воді протягом ЗО хв. Чи можна їх вважати стерильни­ми?

Домашнє завдання

Підготуйтеся до практичного заняття 5.

Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття 5

1. Ознайомтеся з темою і метою практичного заняття, запи­шіть у щоденнику тему і план заняття.

2. Вивчіть теоретичний матеріал (див. підручник, с. 136— 164; практикум, с. 67—78).

Практичне заняття 5 СЕРОЛОГІЧНИЙ МЕТОД ДОСЛІДЖЕННЯ

Мета заняття:

— навчитися пояснювати роль антигенів як індукторів імунної відповіді;

— навчитися пояснювати роль антитіл в імунній відповіді;

— розуміти суть серологічного методу дослідження;

— мати поняття про діагностичні препарати;

— уміти проводити реакцію аглютинації.

Оснащення: адсорбована аглютинуюча полівалентна еше-рихіозна сироватка ОКА в ампулах і розчинена та розлита у стерильні пробірки, в які вмонтовані пастерівські піпетки, сте­рильний ізотонічний розчин натрію хлориду (у пробірках), сте­рильні піпетки об'ємом 1—2 см3, гумова груша, чиста культура Е. coli на скошеному МПА, предметні стекла, бактеріологічні петлі, пінцети, спиртівка, сірники, маркери, дезінфекційний розчин, спирт, вата, заздалегідь поставлена розгорнута реакція аглютинації, бланк направлення.

План

1. Серологічні реакції, їх застосування.

2. Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Об­лік та оцінювання її результатів.

3. Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів.

Хід заняття 1. Серологічні реакції, їх застосування

Завдання 1. Ознайомтеся з умовами проведення сероло­гічних реакцій та їх застосуванням.

Серологічні реакції ґрунтуються на взаємодії антигену зі специфічним антитілом. Оскільки ці реакції високоспецифіч-ні, чутливі і можуть відбуватися in vitro, їх широко використо­вують у лабораторній практиці.

За допомогою серологічних реакцій можна вирішити дві проблеми: .

1) визначити невідоме антитіло або невідомий антиген у си­роватці крові хворого — серологічна діагностика;

2) визначити рід, вид, тип збудника, виділеного із патоло­гічного матеріалу хворого, — серологічна ідентифікація культури мікроорганізмів.

Проведення серологічних реакцій потребує підготовки по­суду, інструментів, апаратури й окремих інгредієнтів (від лат. індгесНепв — той, що входить), тобто окремих компонентів реакції: антитіла, антигену і неспецифічних компонентів.

Для постановки серологічних реакцій використовують чистий, сухий скляний посуд: аглютинаційні, преципітаційні, центрифужні пробірки, піпетки градуйовані (або піпеточний дозатор) і пастерівські, чашки Петрі, предметні стекла. Скло має бути прозорим, без плям і подряпин. Для проведення серологічної реакції у пробірках слід підібрати їх так, щоб вони були однаковими за висотою і діаметром, мали однакову конфігурацію дна, однаковий колір скла.

Замість пробірок часто використовують полістиролові планшети багаторазового й одноразового використання. На планшеті є лунки, однакові за розміром і конфігурацією дна. їх використовують для постановки реакцій гемаглютинації, мікропреципітації, ІФА.

Використовують такі інструменти й апаратуру: бактеріологічну петлю, пінцет, штативи з гніздами, що відповідають діаметру пробірок, лупу, аглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифугу на 2000—3000 об/хв.

Специфічними компонентами серологічних реакцій є імунна діагностична сироватка (відоме антитіло) і діагностикум (відомий антиген).

Імунними діагностичними називають сироватки, що міс­тять відомі специфічні антитіла. їх виготовляють із крові тварин (кроликів, коней, ослів, овець), яких попередньо іму­нізують (заражають) відповідним антигеном (мікробами чи токсином) за певною схемою. Після накопичення антитіл (при­близно через 2 тиж після останнього введення антигену) беруть кров і виробляють із неї сироватку. В отриманій сироватці ви­значають активність (титр). Титр — це найбільше розведення, в якому сироватка спричинює видиму реакцію з відповідним антигеном в умовах досліду. Сироватки розливають в ампули, частіше їх ліофілізують, потім запаюють. На ампулі зазнача­ють назву сироватки, її об'єм і титр. Перед використанням їх розчиняють у дистильованій воді або ізотонічному розчині на­трію хлориду (як зазначено в інструкції). Зберігають сироватки у холодильнику за температури від 4 до 10 °С.

Імунні діагностичні сироватки бувають нативні (неад-сорбовані) й адсорбовані.

Неадсорбовані сироватки містять природні антитіла, які накопичилися в крові упродовж життя тварини, групові антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що мають однакові антигени (бактерії одного роду, родини), — це неспецифічні антитіла та специфічні антитіла, які здатні взаємодіяти з бактеріями, що були використані для імунізації тварин.

Імунна діагностична сироватка містить набагато більше специфічних антитіл, ніж неспецифічних. Після розведення неадсорбованих сироваток концентрація неспецифічних антитіл стає настільки малою, що вони не здатні спричинити видиму реакцію з антигеном, а концентрація специфічних антитіл хоч і зменшується, але залишається достатньою, щоб зумовити видиму реакцію з антигеном. Тому під час проведення серологічної реакції неадсорбовані сироватки обов'язково розводять до титру, вказаного на етикетці.

Адсорбовані імунні діагностичні сироватки високоспеци-фічні. Неспецифічні антитіла з них видаляють методом ад­сорбції.

Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепторними (містять антитіла до одного антигену) і полівалентними (містять антитіла до 2 антигенів і більше). Титр антитіл в адсорбованих сироватках невисокий (від 1:20 до 1:320), тому їх не розводять. Адсорбовані сироватки використовують для проведення реакції аглютинації на склі з метою вивчення антигенної структури бактерій, тобто для серологічної ідентифікації культури.

Ампули з ліофілізованими сироватками вміщують у короб­ки, в кожну коробку кладуть інструкцію щодо використання сироватки.

На коробці зазначають назву сироватки, її призначення, кількість ампул, об'єм в 1 ампулі, серію, термін придатності, умови зберігання, адресу підприємства-виробника, крім того, для неадсорбованих сироваток зазначають титр.

В інструкції зазначають: назву сироватки, її призначення, спосіб застосування, схему проведення серологічної реакції і врахування її результатів, термін придатності сироватки, умови зберігання і транспортування, адресу підприємства, що виготовило препарат.

На ампулі зазначають: назву сироватки, об'єм, серію, конт­рольний номер, дату придатності, на ампулах з неадсорбовани-ми сироватками — титр.

Перед використанням звертають увагу на термін при­датності, цілість ампули, чіткість підписів на ампулі, відпо­відність підпису на ампулі, інструкції й на коробці, фізичні властивості препарату (відповідність зовнішнього вигляду до зазначеного в інструкції) і розчиняють в об'ємі ізотонічного розчину натрію хлориду, який зазначено на етикетці.

2. Проведення орієнтовної реакції аглютинації на склі. Облік та оцінка її результатів

Аглютинація (від лат. аШВІиИпаИо — приклеювання) — це склеювання і випадання в осад клітин (у мікробіології — бакте­ріальних клітин) після їх взаємодії зі специфічними антитіла­ми. Тому результатом реакції аглютинації є утворення пластів­ців унаслідок склеювання бактеріальних клітин. Осад в реакції аглютинації називається аглютинатом.

Орієнтовна реакція аглютинації на склі частіше використо­вується для визначення антигенної структури мікроорганізмів, але інколи і для прискореної серологічної діагностики (реакція Хеддльсона для діагностики бруцельозу).

Завдання 2. Проведіть орієнтовну реакцію аглютинації на склі та облік її результатів з метою ідентифікації куль­тури бактерій.

Проведення реакції аглютинації (РА) на склі з метою серо­логічної ідентифікації культури є завершальним етапом іден­тифікації багатьох мікробних культур після попереднього їх вивчення за культуральними, морфологічними, тинкторіаль-ними і ферментативними властивостями. Для постановки цієї реакції використовують інгредієнти: специфічну аглютинуючу адсорбовану сироватку (відоме антитіло), підготовлену згідно з інструкцією, ізотонічний розчин натрію хлориду і невідому, але підозрілу культуру (невідомий антиген).

Алгоритм "Проведення та облік результатів орієнтов­ної Р А":

— знежирте предметне скло, нанесіть маркером три кола діаметром близько 1 см на однаковій відстані одне від од­ного, скло переверніть;

— підпишіть: під І колом — Д (дослід), під II — КС (конт­роль сироватки), під III — КА (контроль антигену), за­значте номер аналізу;

— зафламбуйте предметне скло, покладіть його у кришку чашки Петрі;

— нанесіть пастерівською піпеткою на кола Д і КС по 1 кра­плі аглютинуючої сироватки, на коло КА — 1 краплю ізо­тонічного розчину натрію хлориду;

— розітріть і змішайте бактеріологічною петлею досліджу­вану культуру з краплею ізотонічного розчину натрію хлориду (КА);

— змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (Д);

— оцініть результати через 1—3 хв;

Увага! Оцінювання результату починають з оцінювання контролів: КА — рівномірне помутніння, КС — крапля про­зора. У разі появи пластівців у колі Д на фоні прозорої рідини реакція позитивна (антиген відповідає антитілу), а в разі рів­номірного помутніння — реакція негативна (антиген не відпо­відає антитілу). Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (реакція мікроаглютинації).

— помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин.

3. Проведення розгорнутої реакції аглютинації. Облік та оцінювання її результатів

Завдання 3. Ознайомтеся з технікою проведення та об­ліком результатів розгорнутої реакції аглютинації.

Розгорнуту реакцію аглютинації здебільшого використову­ють для серологічної діагностики інфекційних хвороб: для діа­гностики черевного тифу — реакцію Відаля, для діагностики бруцельозу — реакцію Райта й інші, визначення титру імунної аглютинуючої сироватки, а також для серологічної ідентифіка­ції культури бактерій (Е. coli, бруцел).

Для проведення розгорнутої реакції аглютинації з метою серологічної діагностики використовують такі інгредієнти: си­роватку крові хворого (невідоме антитіло), діагностикум (відо­мий антиген) та ізотонічний розчин натрію хлориду.

Для серологічного дослідження у хворого беруть кров на 5—7-й день від початку захворювання, коли в ній накопичить­ся достатня кількість антитіл; у реконвалесцента — з метою ретроспективного діагнозу; у здорової людини — з метою вияв­лення латентної інфекції або бактеріоносійства.

Кров слід брати натще або не раніше ніж через 6 год після споживання їжі, оскільки в ній можуть накопичуватися краплі жиру, що робить сироватку каламутною (хільозна сироватка) та непридатною для дослідження. Найчастіше кров забирають із ліктьової вени або з пучки IV пальця, можна брати із мочки вуха, у дітей грудного віку — із п'ятки.

Забір крові потрібно проводити в асептичних умовах та з до­триманням правил техніки безпеки.

На суху чисту стерильну пробірку наклеюють етикетку, в якій зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення), або місце, де був взятий матеріал, прізвище, ім'я та по батькові хворого, дату і час взяття матеріалу. Окремо заповнюють бланк направлення встановленого зразка, в якому зазначають: номер і назву матеріалу, заклад (відділення) або місце, де був взятий матеріал, кратність направлення матеріалу (первинно чи по­вторно), прізвище, ім'я та по батькові хворого, його вік, дату захворювання, попередній діагноз, мету дослідження, дату і час взяття матеріалу, прізвище та посаду особи, яка направляє матеріал на мікробіологічне дослідження.

Потім одягають маску і гумові рукавички, ретельно обро­бляють ділянку шкіри на ліктьовому згині послідовно двома ватними тампонами, змоченими 70 % етиловим спиртом. Кров беруть стерильним шприцом в об'ємі 3—5 см3. Для запобігання гемолізу голку знімають зі шприца, а кров обережно вилива­ють через канюлю у стерильну пробірку так, щоб вона стікала по стінці пробірки. Пробірку закривають гумовою пробкою. Краще збирати кров у спеціальну пробірку типу "Епендорф". Потім кров доставляють до лабораторії не пізніше 2—3 год у спеціальних контейнерах або біксах, на дно яких кладуть сер­ветку з адсорбівного матеріалу. Направлення на дослідження упаковують окремо.

Забороняється обертати направлення навколо посудини з об'єктом дослідження та вкладати його в контейнер або бікс!

Для отримання сироватки кров вміщують у термостат за температури 37 °С на ЗО хв (довше залишати не можна, оскіль­ки відбудеться гемоліз). Утворений згусток відокремлюють від стінок пробірки стерильною запаяною пастерівською піпеткою або скляною паличкою і ставлять у холодильник за температу­ри 4—10 °С на 1—2 год, а для кращого відстоювання — на 18— 20 год. Можна відділяти сироватку центрифугуванням.

Сироватку можна зберігати над згустком не довше ніж 48 год (пізніше настає гемоліз). Якщо сироватка буде викорис­тана пізніше ніж через 48 год, її відсмоктують стерильною пі­петкою з гумовою грушею і переносять у стерильну пробірку. Чиста стерильна сироватка зберігається у холодильнику до 1 міс. Головна вимога до сироватки — її прозорість.

← Предыдущая страница | Следующая страница →